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1、第九章 分子生物学研究方法(2) 1 第四节 DNA重组技术 一、目的DNA片段的获得 二、载体 （质粒、噬菌体、cos质粒、病毒 ） 三、DNA酶切 四、DNA的连接和转化 五、重组质粒的筛选和鉴定 1. 质粒DNA的提取 2. 质粒DNA的纯化 3. 重组质粒的筛选和鉴定 2 DNA重组 DNA重组是指在体外将含有目的基因或其它有意义的 DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿 主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程 。又称DNA克隆、分子克隆、基因操作。 3 重组DNA技术史上的主要事件 1967年 第一次发现DNA连接酶 1970年 分离了第一种限制性内切
2、核酸酶，发现了反转录酶 1972年 获得第一个重组DNA分子 1973年 完成第一例细菌克隆 1975-1977年 发明了DNA序列测定技术，1977年完成了全长5387bp 噬菌体f174基因组测定 1978年 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰 岛素 1981年 获得转基因小鼠和转基因果蝇 1983年 获得第一例转基因植物 1986年 GMO首次在环境中释放 1994年 第一批基因工程西红柿在美国上市 2000年 完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定(1.2X108bp) 2001年 完成第一个人类基因组全序列测定(2.7X109bp) 2005年 中、美、日科学家联合
3、完成水稻基因组全序列测定4 第一个 DNA 重组子 （Paul Berg, 1972） EcoRI recognition sites phage DNA EcoRI cuts DNA into fragments Sticky end SV40 DNA The two fragments stick together by base pairing DNA ligase Recombinant DNA 5 DNA重组的一般步骤 1. 从生物有机体基因组 中，分离出带有目的基 因的DNA片段。 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连 接到能够自我复制的并具有选择记号 的载体分子上，形成重组DN
4、A分子。 6 3. 将重组DNA分子转移 到适当的受体细胞（亦 称寄主细胞）并与之一 起增殖。 4. 从大量的细胞繁殖群 体中，筛选出获得了重 组DNA分子的受体细胞 ，并筛选出已经得到扩 增的目的基因。 7 8 酶 类功 能 限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNA DNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段 连接成一个DNA分子 DNA聚合酶I（大肠杆菌 ） 按5到3方向加入新的核苷酸，补平DNA 双链中的缺口 反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基 互补原则合成DNA链 多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH末 端（进行末端标记实验或用来进行DNA 的连接 末端转
5、移酶在双链核酸的3末端加上多聚单核苷酸 DNA外切酶III从DNA链的3末端逐个切除单核苷酸 噬菌体DNA外切酶从DNA链的5末端逐个切除单核苷酸 碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5或3末端的磷酸基团 重组DNA实验中常见的主要工具酶 9 生物基因组DNA 细胞mRNA反转录合成的单链cDNA 通过机械切割、核酸限制性内切酶消化等处理成适 合克隆的DNA小片段 通过PCR技术可以获得目的基因 人工化学直接合成 一、目的DNA片段的获得 10 （一）特点 基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组 DNA分子进入适当宿主细胞自主复制的DNA分子。 二、载体 1. 在宿主细胞中有独立的复制和表达的
6、能力，这样才能使外源重组的 DNA 片段得以扩增。 2. 分子量尽可能小，多拷贝、松驰控制型。 3. 能插入较大的外源DNA 片段。 4. 载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标 记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性） 。 5. 载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片 段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切 位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有 利于重组子的筛选。 11 多克隆位点 lacZ 载体名称 载体大小 选择性标记基因 多克隆位点(multiple cloning sites，MCS
7、) 指多个限制性内切 酶的单一切点。 由许多限制酶切位点组成，往往是人工合 成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。 12 （二）类型 从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为： 克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。 DNA 克隆常用的载体有： 质粒载体（plasmid），如PBR322、PUC系列、PGEM 系列 和pBluescript（简称pBS）等； 噬菌体载体（phage）； 柯斯质粒载体（cosmid）； 单链DNA 噬菌体载体（ssDNA phage ）； 噬粒载体（phagemid）； 酵母人工染色体（YAC）； 细菌染色体克隆载体（BAC）等。 13 1. 质粒载体
8、 是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb 不 等，为双链、闭环的DNA 分子，并以超螺旋状态存在于 宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中 ，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定 的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点: 分子量小，稳定存在，较高拷贝数； 遗传标志； 内切酶点。 14 （1）pBR322质粒载体 1 2 3 来源于pSF2124质 粒转座子Tn3的氨 苄青霉素抗性基 因（ampr） 来源于pSC101 质粒的四环素 抗性基因（ tertr） 来源于ColE1的派生质粒 pMB1的DNA复制起点（ori ） 15
9、（2）pUC质粒载体 氨苄青霉素 抗性基因 (ampr) 大肠杆菌-半 乳糖酶基因 (lacZ)的启动子 及其编码-肽 链的DNA序列 位于lacZ基 因中的靠近5 -端的一段多 克隆位点 (MCS)区段 ，它并不破 坏该基因的 功能。 来自pBR322 质粒的复制起 点（ori） 16 （3）pMD19-T质粒 17 2. 噬菌体载体 （1）噬菌体的生物学特性 溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后 进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使 寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。(烈性噬菌体只具有 溶菌生长周期) 溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主
10、细 胞染色体上并可以随着寄 主细胞的分裂而进行复制。 (温和噬菌体具有溶源生长 周期和溶菌生长周期) 18 （2）噬菌体 A. 生物学特性 组成：蛋白质外壳和线状 双链DNA分子组成。 DNA长度为48502bp，在 分子两端各有12个碱基的单链 互补粘性末端。当其注入到寄 主细胞中后，可以迅速通过这 两个粘性末端的互补作用形成 双链的环形DNA分子。上述通 过粘性末端互补形成的双链区 被称为cos位点（cohesive end site）。 19 温和噬菌体 一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长 周期。 复制 溶源周期随溶源细菌染色体一起复制; 溶菌周期的早期是“”复制，晚期进
11、行滚环复制 基因组成 DNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排 列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1 3为非必须区段。 20 B. 类型 插入型 （Insertion vectors） 这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。 如：gt10 、 gt11 克隆能力小，不到10kb 置换型 （Replacement vectors） 这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间 的DNA区段是噬菌体的非必需序列，可以被外源插入 的DNA取代。 如：Charon 4 载体 克隆能力大，2025kb 21 （3）M13噬茵体 单链闭合环状噬菌体 只能感染雄
12、性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约 6.4kb，可分为10个区和507 bp基因间隔区（IS区），该 区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力 。这是该噬菌体能用作单链DNA载体的重要前提。 22 复制与增殖 (1)M13(+)链DNA进入细胞内部 (2)合成出互补的(-)链 DNA, 此双链形式 的M13 DNA，称为复制型 DNA。 (3)按形式进行几轮复制之后，基因 的产物便在RF DNA的正链特定位点 上作切割反应，形成一个缺口。 (4)M13基因组利用大肠杆菌的DNA聚合 酶I，以环形的MI3(-)DNA为模板合成 M13(+)DNA。当DNA复制叉沿着模板 DNA分子转
13、移到复制终点时，在基因 编码产物的作用下，新合成的 (+)DNA便会被切除下去，并进一步环 化形成单位长度的 M13基因组DNA。 23 3、柯斯质粒载体 柯斯质粒(cosmid)又称粘 粒， “cosmid”一词是由 英文“cos site-carrying plasmid”缩写而成的，其 原意是指带有粘性末端 位点的质粒。所谓柯斯 质粒其实是一类由人工 构建的含有DNA的cos 序列和质粒复制子的特 殊类型的质粒载体，具 有与质粒相同的结构特 点，为双链、环状DNA 。 24 柯斯质粒具有下列特点： 具有质粒载体的特性。 带有噬菌体的粘性末端(cos区) 。 一个或多个酶切位点。 具有高容
14、量的克隆能力。 非重组体粘性质粒很小，不能在 体外包装，因而有利于重组体的筛 选。 25 类型：（1）重组型病毒载体 （2）无病毒基因的病毒载体复制缺陷型 可复制型 复制缺陷型 4. 病毒载体 组成：（1）病毒复制和包装元件 （2）病毒基因 （3）插入的外源基因或元件 （4）病毒外壳/外膜 26 优点：（1）利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； （2）复杂的装配过程由细胞完成； （3）不同的病毒载体具有不同的表达特点。 27 常用的病毒载体的特点： 病毒载体生物学特性适用范围 反转录病毒载体 单链RNA病毒 810kb 可感染分裂细胞； 整合到染色体中； 表达时间较长； 有致癌的危险；
15、Ex vivo基因治疗； 肿瘤基因治疗。 腺病毒载体 双链DNA病毒 36kb 可感染分裂和非分裂细胞； 不整合到染色体中； 外源基因表达水平高； 表达时间较短； 免疫原性强； In vivo基因治疗； 肿瘤基因治疗； 疫苗。 AAV病毒载体 单链DNA病毒 5kb 可感染分裂和非分裂细胞； 整合到染色体中； 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因； 在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组 织中表达较高； In vivo 基因治疗； Ex vivo基因治疗； 遗传病基因治疗； 获得性慢性疾病的 基因治疗。 HSV病毒载体 双链DNA病毒 152kb 具有嗜神经性；可逆轴突传递； 可潜伏感染； 容
16、量大； 可感染分裂和非分裂细胞； 神经系统疾病的基 因治疗； 肿瘤的基因治疗。 28 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰 酶活性可分为、型三大类。 类和类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化 作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切 割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的 特异性切割末端。 类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离 下来。 故类和类酶在基因工程中基本不用。 1. 限制酶的类型 三、DNA酶切 29 型酶 型酶就是通常指的DNA限制性内切酶. 它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割 ，产生特异的DNA片段； 型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识
