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1、实验二 BCA法测定蛋白质浓度 (BCA protein concentration determination ) 耿 磊 生物化学教研室 （301室） 邮箱：sypgl 1 内容 注意事项 前 言 实验目的 实验原理 思 考 实验步骤 2 前 言 前言 一、蛋白质的理化性质？ （一）、蛋白质的胶体性质 （二）、蛋白质的两性电离和等电点 （三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚 （四）、蛋白质的紫外吸收 （五）、蛋白质的呈色反应 3 （一）、蛋白质的胶体性质 前言 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100 万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之 内。 蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表
2、面电荷、水化膜 4 （二）、蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基 侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负 电 荷或正电荷的基团。 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子 的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 称为蛋白质的等电点。 前言 5 （三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚 * 蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破 坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其 理化性质改
3、变和生物活性的丧失。 * 蛋白质沉淀（precipitation） 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互 缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉 淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此 凝块不易再溶于强酸和强碱中。 前言 6 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸， 因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与 其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 前言 （四）、蛋白质的紫外吸收 7 （五）、蛋白质的呈色反应 前言 蛋白质分子中的肽键
4、及氨基酸残基的各种特殊基团，在一 定条件下可以和某些化学试剂呈现一定的颜色反应，颜色的 深浅与其浓度成正比。 茚三酮反应(ninhydrin reaction) 双缩脲反应(biuret reaction) 3.Folin-酚试剂反应 8 前言 二、蛋白质的测定方法 ？ （一）紫外线吸收法 （二）双缩脲法 （三）Folin-酚试剂法 （四)考马斯亮蓝结合法 （五）改良微量凯式定氮法 （六）BCA法 9 前言 (一）紫外吸收法 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含 有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸 收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶 液的光吸收值(OD280
5、)与其含量呈正比关系，可用作 定量测定。 优点：是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类 不干扰测定。 缺点：准确度较差，嘌呤、嘧啶、核酸等容易干 扰测定。 10 前言 （二）双缩脲法 H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3 双缩脲 双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成 紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。 优点：操作简便、迅速、受蛋白质性质影响较小。 缺点：灵敏度较差，本法测定蛋白质范围1-20mg； 特异性不高 11 前言 蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因此有 双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。 Foli
6、n酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试 剂(磷钼酸磷钨酸试剂)，蛋白质铜络合物能还原 磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下 ，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。 优点：是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏 1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。 缺点：其不足之处是此反应受多种因素干扰。 （三）Folin-酚试剂法 12 考马斯亮蓝G-250染料在酸性条件下能与蛋白质结合， 使染料的最大吸收峰值从465nm变成595nm，溶液的颜色 由棕红色变为蓝色，在595nm测定的吸光度值与蛋白质浓 度成正比，故可用于蛋白质定量测定。 优点：简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry 法
7、灵敏4倍）。 缺点：用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；大量去垢 剂会使显色反应受到干扰；标准曲线有轻微的非线性；比 色 杯染色严重，影响重复性。 前言 （四)考马斯亮蓝结合法 13 蛋白质是机体内主要的含氮物质，而且氮元素的含量相 当恒定，一般为16%，其他非蛋白质的含氮化合物所占得氮 量甚微。因此，测定生物样品的含氮量，即可推算蛋白质 含 量。 优点：准确度高，可测定不同形态样品。 缺点：灵敏度低，适用于0.21.0mg氮，误差为2 费 时。 前言 （五）改良微量凯式定氮法 14 （六）BCA法 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+,Cu+与BCA试剂形 成 紫颜色的络合物，测定其在562
8、nm处的吸收值，并与标准曲 线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 优点：操作简便、快速、灵敏度高，准确，试剂稳定 性 好，经济实用，抗干扰能力强。 前言 15 BCA蛋白质检测流程： 前言 16 前言 17 前言 18 1.学习掌握BCA法测定蛋白质浓度的 原理。 2.掌握721型分光光度计的使用。 3.了解蛋白质测定的多种方法，并比较其 优缺点。 实验目的 实验目的 19 实验原理 BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸）碱性条件 下，蛋白将Cu+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成 紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值， 并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 BC
9、A分子式： 实验原理 20 原理图： 实验原理 21 实验步骤 实验步骤 （一）实验材料 1、器材 721型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管 2、试剂 (1)试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒石酸 钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体混合后 调pH至11.25。 （2）试剂B：4%硫酸铜。 （3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2L，混合。 （4）蛋白质标准液：准确称取150mg牛血清白蛋白，溶于 100mL蒸馏水中，即为1.5mg/mL的蛋白质标准液。 (5)待测样品。 22 实验步骤 （二）操作 23 1、将上述各管混匀后于37C保温30分钟
10、， 用562nm波长比色测定吸光度值。 2、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵 坐标绘制标准曲线。 3、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相 应的蛋白质含量，再计算出待测血清中蛋 白质浓度（g/L)。 实验步骤 24 注意事项 1、紫外分光光度计的正确使用。 2、试剂的准确量取，按操作表的顺序依次 添加试剂。 3、待测样品浓度在502000微克毫升浓 度范围内有较好的线性关系。 4、注意安全，保护好仪器。 注意事项 25 1、试比较BCA法与双缩脲、Lowry法 的异同。 2、BCA法常用于科研，其有哪些特点 。 思考 26 1）预热仪器。 2）选定波长。 3）固定灵敏度档。一般测量固定在“1” 档。 4）调节“0”点。 5）调节T=100。 6）测定。 7）关机。 紫外分光光度计的使用 27 下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 预习要点： 1、复习蛋白质两性解离。 2、预习电泳的基本原理。 3、结合几种蛋白质的等电点，为什么将点样端 置 于阴极？ 4、为什么跑在最前面是清蛋白？而跑在最后面 是 r-球蛋白？ 5、如何辨认各条带？ 6、请简要写出操作流程图。 7、请写出计算公式。 28 欢迎大家提宝贵意见！欢迎大家提宝贵意见！ 29
