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1、基因工程 专题专题1 1 基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路科技探索之路 后后 期期 基基 础础 理理 论论 艾弗里艾弗里证明证明 ，DNADNA可从一种可从一种 生物个体生物个体转移转移到另一种生物个体。到另一种生物个体。 DNADNA是遗传物质是遗传物质 基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路科技探索之路 后后 期期 基基 础础 理理 论论 DNADNA的的双螺旋结构双螺旋结构和和中心法则中心法则的确立。的确立。 基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路科技探索之路 后
2、后 期期 基基 础础 理理 论论 19631963年年尼伦伯格尼伦伯格和和马太马太破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的 遗传密码遗传密码，19661966年年霍拉纳霍拉纳用实验加以证明。用实验加以证明。 基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路科技探索之路 1)1)基因转移载体的发现基因转移载体的发现 2)2)工具酶的发现工具酶的发现 3)DNA3)DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明 4) DNA4) DNA体外重组的实现体外重组的实现 5)5)重组重组DNADNA表达实验的成功表达实验的成功 6)6)第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世 7)
3、PCR7)PCR技术的发明技术的发明 基因工程的产物基因工程的产物 一、基因工程的概念： 又叫做基因拼接技术基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术。通 俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物 的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后 放到另一种生物的细胞里，定向定向地改造生物 的遗传性状遗传性状。 原理 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 基因重组 生物体外 基因/DNA 分子水平 剪切拼接导入表达 人类需要的基因产物 回顾： 优点： 定向定向地改造生物的遗传性状遗传性状； 实现基因在不同物种之间的转移，迅速培育 出生物新品种 问题探讨： 苏云金芽孢杆菌含有一种可 以合成毒蛋白的基
4、因.让细菌的 毒蛋白基因在棉花细胞中表达 ，可培育出抵抗棉铃虫害的抗 虫棉。 想一想需要做哪些关键工作 ？ 苏云金芽孢杆菌 毒蛋白毒蛋白 普通棉花 抗虫棉 DNA重组技术的基本工具 工欲善其事 , 必先利其器 . 想一想:获得转基因抗虫棉关键步骤或难点是什么关键步骤或难点是什么? 实现这一精确的操作过程的工具是什么呢? 基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤： 关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内细胞内提取出来提取出来 关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与棉花与棉花DNA“DNA“缝合缝合” ” 关键步骤三：关键步骤三：抗虫
5、基因抗虫基因进入棉花细胞进入棉花细胞 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？ “分子手术刀分子手术刀” 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内提取出来细胞内提取出来 关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因与棉花抗虫基因与棉花DNA“DNA“缝合缝合” ” 关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞抗虫基因进入棉花细胞 “分子缝合针分子缝合针” DNADNA连接酶连接酶 “分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体 1.11.1、DNADNA重组技术的基本工具重
6、组技术的基本工具 一、限制性核酸内切酶“分子手术刀” 1.主要来源： 2.种类与命名： 3.作用特点（特异性 ） 4.限制酶识别序列 5.作用结果： 识别识别特定特定核苷酸序列，并且使每条链中核苷酸序列，并且使每条链中特定部特定部 位位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化 产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端 Go onGo on 大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由6 6个核苷酸组成个核苷酸组成 少数的识别序列由少数的识别序列由4 4、5 5或或8 8个核苷酸组成个核苷酸组成 思考与探究思考与探
7、究 P7 P7 （ 2 2 ） 为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNADNA？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶 的细胞，其的细胞，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备不具备这种限制酶这种限制酶 的的识别切割序列识别切割序列；或者通过甲基化酶；或者通过甲基化酶将甲基将甲基转转 移到所移到所识别序列识别序列的碱基上，使的碱基上，使限制酶不能将其限制酶不能将其 切开切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不 会使自身的会使自身的DNADNA被切断，并且可以防止外源被切断，并且可以防止外源DNADN
8、A 的入侵。的入侵。 种类与命名： 现在已经从约300种微生物中分离出了约 4000种限制性内切酶(限制酶)。 E EcocoR R S Smama 粘质沙雷氏杆菌 （Serratia marcesens） 大肠杆菌大肠杆菌 （EscherichiaEscherichia coli coli R R） Go backGo back 练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d ) 中先后分离到3种限制酶，则分 别命名为: Hind、Hind和Hind O 限制酶DNA解旋酶 区别 限制性内切酶与限制性内切酶与DNADNA解旋酶的区别解旋酶的区别 切割特定的核苷
9、酸序列 的磷酸二酯键 将DNA两条链的氢键 打开形成两条单链 限制酶DNA水解酶 区别 限制性内切酶与限制性内切酶与DNADNA水解酶的区别水解酶的区别 切割特定的核苷酸序列 的磷酸二酯键，形成片 段的DNA. 切割磷酸二酯键，形成 单个的脱氧核苷酸。 限制酶的识别序列：限制酶的识别序列： 能被限制性内切酶特 异性识别的切割部位 都具有回文序列：在 切割部位，一条链正 向读的碱基顺序与另 一条链反向读的顺序 完全一致。 EcoREcoR 黏性末端 黏性末端 Go backGo back EcoREcoR 黏性末端 黏性末端 重复演示重复演示 什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的被限
10、制酶切开的DNADNA两条单链的切口两条单链的切口 ，带有几个，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，它们之间正好，它们之间正好 互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。 SmaSma 平末端 平末端 限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6 6个碱基个碱基 还是还是4 4个碱基，都可以找到一条个碱基，都可以找到一条中轴线中轴线（如（如 图），中轴线两侧的双链图），中轴线两侧的双链DNADNA上的碱基是上的碱基是反反 向对称、重复排列向对称、重复排列的。的。 想一想限制酶所识别的序列有什么特点？想一想限制酶所识别的序列有什么特点？ 要想获得某个特定性状的基因必须
11、要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制 酶切几个切口？可产生几个黏性酶切几个切口？可产生几个黏性( (平平) )末端？末端？ 要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性( (平平) )末端。末端。 如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？ 会产生会产生相同的黏性相同的黏性( (平平) )末端末端，然后让两，然后让两 者的黏性者的黏性( (平平) )末端末端黏合黏合起来，就似乎可以合起来，就似乎可以合 成重组的成重组的DNADNA分子了。分子了。 思考思考? ? GAATTCGAATTC CTTAAG
12、CTTAAG GAATTCGAATTC CTTAAGCTTAAG EcoREcoR GGAATTCAATTC CTTAACTTAAGG GGAATTCAATTC CTTAACTTAAGG 不同来源的不同来源的DNADNA片段混合片段混合 将不同种来源的将不同种来源的DNADNA片段连接起来片段连接起来 生物生物A A基因片段基因片段生物 生物B B基因片段基因片段 GG AATTCAATTC CTTAACTTAA GG 酶切酶切 GAATTCGAATTC CTTAAGCTTAAG GG AATTCAATTC CTTAACTTAA GG GG AATTCAATTC CTTAACTTAA GG 同
13、一种 二、“分子缝合针” DNA连接酶 作用作用: : 把切下来的把切下来的DNADNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNADNA， 即将即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来. . 作用原理：作用原理： 催化磷酸二酯键形成 类型：类型： 类型 EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶 T T4 4 DNADNA连接酶连接酶 来源来源 功能功能 大肠杆菌大肠杆菌 T T4 4 噬菌体噬菌体 恢复恢复 磷酸磷酸 二酯键二酯键 只能连接只能连接黏性末端黏性末端 能连接能连接黏性末端黏性末端和和 平末端平末端( (效率较低效率较低) ) 相同点相同点差别差别 可把黏性末端之间的可把黏性末
14、端之间的缝隙缝隙“ “缝合缝合” ”起来，起来， EcoliEcoli DNA DNA连接酶 或连接酶 或T T 4 4 DNADNA连接酶连接酶 即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“ “缝合缝合” ”起起 来，但效率较低来，但效率较低 T T4 4 DNADNA连接酶连接酶 DNA聚合酶DNA连接酶 区别1 区别2 相同点 寻根问底寻根问底 DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗? ?为什么为什么? ? 1)只能将单
15、个核苷酸连 接到已有的核酸片段上 ，形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键 1)在两个DNA片段之 间形成磷酸二酯键 2)以一条DNA链为模板 ，将将单个核苷酸单个核苷酸通过磷 通过磷 酸二酯键酸二酯键连接成一条互 补的DNA链 2)将DNA双链上的两 个缺口同时连接起来 ，不需要模板 三、“分子运输车” 基因进入受体细胞的载 体 载体需要的条件： 有1多个限制酶切点 对受体细胞无害 导入基因能在受体细胞中复制、表达 有某些标记基因，便于筛选 常用运载体： 细菌的质粒 噬菌体衍生物或某些动植物病毒 假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能 转录，转基因生物能有预想的效果吗？ 作为分子运输车载体，如果没有切割位点 将会怎样？ 霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做 分子运输车吗？ 目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？ 常用的载体：质粒常用的载体：质粒 能复制并带着能复制并带着 插入的目的基插入的目的基 因一起复制因一起复制 有切割位点有切割位点 有标记基因的有标记基因的 存在，可用含存在，可用含 氨苄青霉素的氨苄青霉素的 培养基鉴别培养基鉴别 3 3、天然的、天然的DNA
