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1、独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：签字日期：2 0 ( ) ， 年厂月皿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (
2、 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：磊甬导师签名渊 签字日期：2 。侈年歹月y 日签字日期：如肛年岁月阳 - ， 目录 摘要I A b s t r a c t I I I 第1 章文献综述一1 1 1 杨树的生物学特征l 1 2 杨树的病害及黑斑病介绍1 1 3 杨树转基因工程进展1 1 4 杨树抗病基因工程研究进展2 1 5 杨树黄酮类化合物的研究概况2 1 5 1 黄酮类化合物的分类及功能2 1 5 2 缩合单宁的分类及功能3 1 5 3 黄酮类化合物的研究进展3 1 5 4 黄酮代谢与植物抗病的关系5 第2 章引言7 2
3、1 研究内容与目标7 2 1 1 研究内容7 2 1 2 研究目标7 2 2 技术路线一8 第3 章实验材料与方法9 3 1 实验材料一9 3 1 1 植物材料9 3 1 2 菌种和质粒9 3 2 仪器和设备一9 3 3 实验试剂9 3 3 1 试剂及试剂盒9 3 3 2 常用抗生素、激素及培养基的配制1 0 3 4 实验方法1 0 3 4 1 基因的进化分析1 0 3 4 2 氨基酸序列比对1 0 3 4 3 毛白杨不同组织R N A 的提取1 l 3 4 4 目的基因的组织特异性分析1 1 3 4 5 基因的引物设计1 3 3 4 6 目的基因的P C R 扩增1 3 西南大学硕士毕业论文
4、 3 4 7 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一1 3 3 4 8 农感菌感受态细胞的制备及转化1 4 3 4 9 毛白杨遗传转化一1 4 3 4 1 0 转基因D N A 的提取1 5 3 4 1 l 转基因植株的分子检测1 6 3 4 1 2 转基因毛白杨的R T P C R 和Q R T - P C R 检测1 6 3 4 1 3 尸t 圳月和P t r A N R 转基因植株中缩合单宁含量和组分的测定1 7 3 4 1 4D M A C A 染色1 7 3 4 1 5 可溶性缩合单宁中儿茶素和表儿茶素含量的测定一1 7 3 4 1 6 花青素含量的测定1 8 3 4 1 7 转基因杨树抗
5、病分析1 8 3 4 1 8 毛白杨感病前后缩合单宁含量变化的比较1 8 3 4 1 9 数字基因表达谱( D G E ) 和荧光定量P C R 分析1 8 3 4 2 0 拟南芥的遗传转化1 9 第4 章结果与分析2 l 4 1 毛果杨L A R 和A N R 与其它物种同源基因的进化分析2 1 4 2 毛果杨枷和A N R 与其它物种L A R 、A N R 的氨基酸序列比对2 1 4 3 毛白杨P t r L A R 和P t r A N R 的组织特异性分析2 5 4 4 缩合单宁在毛白杨不同组织中的含量分析2 6 4 5 杨树P t r A N R 和P t r L A R s 的克
6、隆及载体构建2 7 4 6 毛白杨的遗传转化及转基因植株的获得2 8 4 6 1 毛白杨的遗传转化2 8 4 6 2 转基因植株的检测2 8 4 7 转基因植株单宁含量的测定3 0 4 7 1D M A C A 染色检测转基因毛白杨不同组织单宁含量3 0 4 7 2P t r L A R l ，P t r L A R 3 转基因植株不同组织中缩合单宁含量分析3 1 4 7 3 凡棚脚和P t r A N R - A s 转基因植株缩合单宁含量分析一3 2 4 8P t r L A R s 和凡州脚转基因植株的表达量分析3 3 4 9P t r L A R l ，P t r A N R 转基因植
7、株儿茶素和表儿茶素含量的测定3 5 4 1 0P t r L A R l ，P t r A N R 转基因植株花青素含量的测定3 8 4 1 1P t r L A R l 转基因拟南芥中儿茶素和表儿茶素含量分析3 8 4 1 2 毛白杨叶片接种黑斑病后数字基因表达谱( D G E ) 分析4 1 4 1 3 野生型毛白杨接种黑斑病后单宁含量的变化4 2 4 1 4P t r L A R 3 转基因植株的抗病性分析4 2 第5 章讨论4 5 参考文献4 9 致谢5 5 攻读硕士学位期间发表的论文5 7 U l 一 4 _ 摘要 杨树单宁合成关键酶基因以庙和A N R 的功能分析 植物学专业硕士研
8、究生袁丽 指导教师罗克明教授 摘要 单宁是杨树体内非常重要的一类次生代谢化合物，广泛参与了杨树抗病、抗虫、抵 御紫外辐射等生理过程。为了阐明杨树中单宁的生物合成代谢途径，本研究克隆了杨树 单宁合成途径中关键酶基因P t r L A R l 、P t r L A R 3 和P t r A N R ，氨基酸序列比对发现， P t r L A R l 、P t r L A R 3 和P t r A N R 与其它物种的同源基因具有较高的相似性，进化分析结 果表明，P t r L A R l 、P t r L A R 3 和P t r A N R 与木本植物的同源基因具有较近的亲缘关系。 半定量和荧光
9、定量P C R 分析P t r L A R s 和P t r A N R 基因的组织特异性发现，它们均在 根中大量表达。对毛白杨不同组织缩合单宁含量的测定显示，缩合单宁也在根中含量最 高，这些结果表明P t r L A R I 、P t r L A R 3 和P t r A N R 可能参与了缩合单宁的代谢合成。 为进一步验证P t r L A R l 、P t r L A R 3 和P t r A N R 基因的功能，将这些基因分别转化毛 白杨，获得转基因植株。测定转基因植株中缩合单宁的含量发现，超量表达P t r L A R l 、 P t r L A R 3 和P t r A N R 均
10、导致转基因植株中可溶性缩合单宁含量显著增加，显示这些基因 均参与了单宁的生物合成。 为了检测P t r L A R 和P t r A N R 超量表达是否影响了花青素的合成，我们也检测了转 基因植株花青素的含量。发现在P t r L A R l 和P t r A N R 转基因植株中花青素含量均有明显 降低，该结果暗示超量表达P t r L A R l 和P t r A N R 导致缩合单宁含量增加，但影响了花青 素的合成。 H P L C 测定转基因植株中单宁的单体发现，超量表达P t r A N R 提高了转基因植物中 表儿茶素的含量，而超量表达P t r L A R l 同时提高了缩合单
11、宁的两种单体儿茶素和表 儿茶素的含量。 前人研究表明，在拟南芥中未发现L A R 及其同源基因，也未检测到儿茶素。为了 进一步验证P t r L A R l 的功能，将P t r L A R l 转化拟南芥进行互补实验。H P L C 检测发现， 在转P t r L A R l 拟南芥中检测到了儿茶素的大量合成，并且表儿茶素的含量也有所提高， 该结果表明，P t r L A R l 能同催化儿茶素和表儿茶素两种缩合单宁单体的合成。 植物中单宁的存在可提高其抗病性。在毛白杨叶片表面接种黑斑病菌4 8h 后，数 字表达谱( D E G ) 检测黄酮代谢途径上关键酶基因的表达情况发现，该途径中大多数关 西南大学硕士毕业论文 键酶基因均明显上调，其中P t r L A R 3 提高尤为显著，同时感染黑斑病的叶片中缩合单宁 含量有了明显提高，推测P t r L A R 3 的表达可能与杨树的抗病性相关。 离体抗病实验表明，超量表达P t r L A R 3 的转基因毛白杨叶片细胞粗提液能够抑制黑 斑病的菌丝生长，活体接种实验显示，接种病原菌4d 后转基因植株叶片的病斑面
