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1、蛋白质分析概述 DNA RNA Protein Metabolism Genome “Genomics” Proteome “Proteomics” Metabolome “Metabonomics” Transcriptome “Transcriptomics” 生命科学的主要研究对象 基因组学 基因组: 一种生物体或个体细胞所具有的一套完整的 基因及其调控序列。 基因组学：研究基因组的结构组成、时序表达模式 和功能，并提供有关物种及其细胞功能的进化信 息。 特点：细胞中全部基因及非编码区的整体性考察和 系统性研究。揭示基因与基因间的相互关系、基因 与非编码序列的关系、基因与基因组的关系。
2、转录组学 转录组: 广义指某一生理条件下，细胞内所有转录产物 的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运 RNA及非编码RNA; 狭义指所有mRNA的集合。 转录组学：对转录水平上发生的事件及其相互 关系和意义进行整体研究的一门科学。 蛋白质组学 蛋白质组:一个细胞、一个组织或一个机体的基因 组所表达的全部相应的蛋白质。 蛋白质组学:从整体水平上研究细胞内蛋白质组成 及其活动规律的一门科学。 研究目的: 对细胞内各种蛋白质的识别与定量化, 确定它们的细胞内外的定位、修饰、相互作用、活 性及其功能。 蛋白质组学分类 表达蛋白质组学(Expression proteomics) -又称定量调节蛋白
3、质组学（quantitative regulation proteomics), 研究在 整体水平上研究生物体蛋白质表达的变化。 细胞谱蛋白质组学(Cell-map proteomics) -又称结构蛋白质组学 (structural proteomics)，研究蛋白质在细胞内行 为、运输和相互作用。 功能蛋白质组学（functional proteomics) -以特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质研究对象。 相同点: 都属于整体概念, 蛋白质组是基因组的反映，但不是一个基因 组的直接产物。 不同点: 基因组: 1.均一性和完整性 2.非常稳定，不易发生改 变 蛋白质组:
4、1.特殊性和多样性 2.可变性，高 度动态 蛋白质组学与基因组学的比较 代谢物组学 代谢组：指某一生物或细胞在一特定生理时 期内所有的低分子量代谢产物。 代谢物组学：定量描述生物内源性代谢物质 的整体及其对内因和外因变化应答规律的科 学。 基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确 实发生了。 人类蛋白组数量 蛋白质组学研究策略 穷尽法：采用高通量的蛋白质组研究技术，力图查清生物体内的一 切蛋白。 差异法：寻找和筛选有意义因素引起不同群体样本间差异蛋白谱， 揭示细胞对此因素的反应途径、进程与本质，同时获得对某些关键 蛋白的认识和功能分析。 蛋白质组信息学整体框架 传统的
5、蛋白质鉴定基于1950年Edman 提出的Edman降解法进行氨基酸测序。 1980年，Shimonishi等将质谱和Edman降解法结合对肽段混合物进行测 序，并针对该方法开发了 相应的计算程序 1984年，Sakurai等基于全面搜索模式（穷举法）发展了自动化的从头 （de novo）肽段测序算法 ，一些改进的算法也陆续出现，如局部法 （图论法）把质谱峰转化成质谱图中的节点，通过构建最 佳路径寻找 氨基酸序列，大大提高了从头测序的效率 上世纪80年代末，电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸电离 （MADIL）两种“软电离”技术的 出现，使得蛋白质等生物大分子的 质谱鉴定成为可能。 90年
6、代以后，利用肽质量指纹（PMF）、串联质谱（MS/MS）数据和 序列标签法，搜索已知蛋白 质序列鉴定蛋白质的算法和软件相继出现， 蛋白质组学研究得到飞跃发展。 随着国际人类基因组计划的完成，蛋白质序列数据库逐渐完善，串联 质谱 和数据库搜索结合来鉴定蛋白质，可以满足蛋白质组学研究高通 量、自动化 的要求，成为人类蛋白质组表达谱研究的重要方法之一。 蛋白质鉴定的发展史 蛋白质组研究的基本技术路线 凝胶电泳（1D Gel 、2-DE) 样品分离 色谱技术（液相色谱、毛细管电泳 ） 一维凝胶电泳（1D Gel ） 二维凝胶电泳（2-DE） 二维凝胶电泳（2-DE） 双向荧光差异凝胶电泳 1. 一次可
7、分离上千种10100 kD分子量 的蛋白质 2. 高分辨率 3. 便于计算机分析处理 -蛋白质定位、等电点、分子量的鉴定 -蛋白质的定量 -建立蛋白质数据库 -不同的图谱可进行比较和分析 4. 与分析鉴定方法相匹配 -转移到PVDF膜上进行N或C端的序列分析 -直接进行蛋白质胶内或膜上酶解与质谱 分析匹配。 2-DE的优点2-DE的缺点 1.难以有效分离的蛋白质： -极酸、极碱性蛋白质 -疏水性蛋白质 -极大蛋白质、极小蛋白质 -低丰度蛋白质 2.胶内酶解过程费时、费力，难 以与质谱联用实现自动化。 凝胶电泳（1D Gel 、2-DE) 样品分离 色谱技术（液相色谱、毛细管电泳） 质谱分析 1
8、.可以获得样品分子量、分子式、分子中 同位素构成和分子结构等多方面的信息 2.高效、灵敏、准确、自动化、可同时分 析多蛋白混合物 3.已逐步取代了传统的Edman降解测序与 氨基酸组份分析法，成为蛋白质鉴定的核 心技术 质谱仪由进样器、离子源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析 系统等组成 电离装置把样品电离为离子 质量分析装置把不同质荷比的离子分开 经检测器检测之后可以得到样品的质谱图 质谱仪的功能模块 质量范围： 质谱仪所检测的单电荷离子的质荷比范围 分辨率(R)： 质谱仪分开相邻两离子质量的能力。 R = m /m m 为质谱仪可分辨的相邻两峰的质量差 m 为可分辨的相邻两峰的平
9、均质量 质量精确度：生物分析物质量的测量值与实际分子量的接近程度 (用百万分率表示，ppm) 扫描速度: 离子检测速度即质谱仪获取数据的速度 质谱仪的主要技术指标 蛋白质鉴定的技术流程图 样品制备 蛋白分离 酶切 肽段分离 质谱鉴定 质谱数据处理过程 数据库搜索 质控和评估 最终鉴定列表的获得 肽质量指纹谱（Peptide Mass Fingerprint，PMF）也称一级质谱 质量精确度不够，一般是对蛋白分离得较彻底的样品，如2DE分离。 肽碎片指纹谱（Peptide Fragment Fingerprint，PFF） 也称二级质谱或串联质谱（MS/MS） 可以提供精确结构信息，一般是对蛋白
10、未分离或分离效果差的样品。 蛋白质鉴定方法 一级质谱（PMF）鉴定法 -费用低廉 -所鉴定蛋白质序列必须已知 -不适用于3种蛋白以上的混合物 -敏感性不够，肽段缺失导致没有结果 -精确性不高 -2DE中只有大约40%的点能得到鉴定 选择某一质荷比的肽段进行MS/MS分析，将产生的碎片离子的数据进行数 据库检索，实现蛋白质的鉴定。 串联质谱：肽段碎片离子鉴定 二级质谱图 质谱数据分析流程 蛋白质组学数据分析软件 串联质谱数据数据库搜索软件列表 16 Nodes in-house Linux Cluster, 32 Xeon CPU, 14.5TB storage server 高性能集群计算机(
11、HPC) Hangzhou National software center, 512 CPU 多搜索引擎整合 基本思路： 将各搜索引擎的鉴定分值转换为统一的概率分值，得到整合的肽段鉴定概 率。整合方法可采用选择搜库分值、特征参数、概率模型等。 各环节标准程序的制定 从大规模数据产出走向数据挖掘 蛋白质鉴定从定性走向定量 研究从基础发现逐步走向临床 蛋白质组研究发展趋势 1.SWISS-PROT/TrEMBL http:/www.expasy.ch/sprot/ 2.Protein Information Resource(PIR) http:/pir.georgetown.edu/ 3.NC
12、BInr http:/www.ncbi.nlm.nih.gov 4.dbEST Genbank 一个分支 5.OWL http:/biochem.ucl.ac 6.UniGene 由NCBI提供 蛋白质数据库 1.AAindex:（氨基酸索引数据库）网址 http:/www.genome.ad.jp/dbget/ 2.GELBANK http:/gelbank.anl.gov 3.Predictome http:/predictome.bu.edu 4.Proteome Analysis Database http:/www.ebi.ac.uk/proteome/ 5.REBASE 6.SWI
13、SS-2DPAGE http:/www.expasy.org/ch2d/ 7.YPL.dp http:/ypl.tugraze.at 蛋白质组数据库 1.Blocks http:/blocks.fhcrc.org 2.CDD http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd/dhtml 3.CluSTr http:/www.cbi.ac.uk/clustr/ 4.InterPro http:/www.ebi.ac.uk/interpro/ 5.Pfam http:/www.sanger.ac.uk/Software/Pdam/ 6.PROSITE htt
14、p:/www.expasy.org/prosite 蛋白质序列基序(Motif)数据库 1. 蛋白质二级结构数据库DSSP http:/www.sander.emblheidelberg.de/dssp/ 2. PredictProtein http:/www.predictprotein.org 蛋白质二级结构数据库 1. PDB http:/www.rcsb.org/pdb/ 2. CPHmodels http:/www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/ 3. MMDB http:/sander.ebi.ac.uk/hssp/ 蛋白质三维结构和相关数据库 Thanks!
