单抗制备技术近十年来进展

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1、单抗制备技术近十年来进展 从人类发明这个技术开始，单抗制备已经有 37 年的历史了，这 37 年以来，主流单抗 制备的基本主线几乎没有什么改变，也就是下面这个流程： 抗原制备 动物免疫 细胞融合 克隆筛选 克隆化（亚克隆） Large-scale 生产、纯化以及鉴定 但是不同的研究人员从不同的角度和细节对整个流程有了独到的视角， 这里我简单地总 结一下近十年以来的发展和前人的经验， 基本都是站长自己道听途说， 加上参阅一些文献总 结出来的， 十年以前的技术革新择重点简要提一提。 抗原制备进展抗原制备进展 抗原，基本上分三类： 蛋白、多肽和小分子化合物。 一般的制备过程没什么好说的了， 主要说多

2、肽和小分子连载体的事。 多肽和小分子因 为免疫原性弱，所以必须连接载体才能诱发免疫应答。 最常用的基本上就是 KLH, BSA,OVA 和 GST， 但是觉得近几年以来，用多肽复合抗原肽（MAP）的比较多。其原理是把多肽或小 分子连在多聚赖氨酸的骨架上，而多聚赖氨酸因为其结构具有高度重复性，所以不会像 KLH 等载体一样使动物产生抗体，这样就不会浪废有限的免疫系统资源。 毛病是这种形式的抗 原在制备成本上贵许多，我记得一个 MAP 的制备报价大约在 1500 元人民币左右。 从获取方式来看，对于蛋白质类抗原，不仅可以重组表达（原核和真核）， 还可以直 接从天然组织或细胞中分离。 早期的时候人们

3、经常干这种事， 那是因为当时没有现在这么普 及的分子生物学技术，很难得到重组蛋白。 但是最近 20 年以来，基本上都用重组蛋白了， 重组蛋白生产技术非常成熟，而且生产也简单，容易扩大规模，但是慢慢地很多人意识到重 组蛋白和天然的蛋白在结构上有时候有着极大的差异， 所以不少人认为确实是天然蛋白免疫 得到的抗体是最好的，有兴趣可以看看这篇文章：Generation and Characterization of a Panel of Monoclonal Antibodies Against Distinct Epitopes of Human CD146，一个典 型的从天然组织中纯化出蛋白作为抗

4、原制备单抗的例子。 在抗原的形式上，也是各式各样，根据自己的需要有不同的喜好，大部份人都推荐接近 天然构象的蛋白，即使是重组蛋白，buffer 也尽量 gentle， 另一些人则喜欢跑胶然后切 胶打动物， 还有的转膜后剪膜免疫动物 （这一个通常和从天然组织中纯化的方法联用） 。 还 有人喜欢用过表达的细胞或转化的细菌作为免疫原 （当然也有全细胞或者细胞组份裂解液作 为免疫原的，此乃后话）。对于做免疫组化用的单抗制备，则还有更特殊的处理手段。 另一些人则认为，用 DNA 直接免疫也许更好。其方法是把 cDNA 连到真核表达载体中， 然后直接注射动物，在佐剂的作用下载体就带着 cDNA 进入动物细

5、胞，然后在动物细胞就有 目的蛋白表达出来， 这些蛋白从细胞释放出来后就可以引起免疫应答 （整个理论还没有建立 完整， 一切都在 YY 中） ， 这种方法免疫中， 现在缺少有效的佐剂， 所以免疫效果很难保证， 不过在比较低的效价下，很多人也可以得到阳性克隆。 说了这么多， 还是很沮丧， 虽然看起来选择很多， 但是能真正用到工作中的选择并不多， 有时候是条件问题，有时候则是成本和精力问题。第一个话题就写这么多吧。 动物免疫动物免疫 动物免疫故事比较多，简单点说。 实验动物的选择： 做单抗的动物最开始是小鼠，后来又有像 epitomics 这样的公司用 兔子的，还有一些人用大鼠神马的，当然其它的动物

6、的也有，据不完全统计，现在能用传统 方法制备单抗的动物已经有二三十种了。 但是最主流的还是小鼠和兔子了。兔子不讨论， epitomics 对其有特殊的专利，这个基本上和咱们没关系。小鼠，用得最多的还是 Balb/C 了，因为大多数骨髓瘤细胞（SP2/0, X63, Ag8.653,FO 和 NSO）都来自于 Balb/C 小鼠，为 了使 hybridomas 稳定，所以实验小鼠基本上还是 Balb/C。 不过有文献提到了用 NZB/W 小 鼠制备高同源性单抗的， 原因是 NZB/W 小鼠是一种容易发生自身免疫疾病的小鼠模型， 一般 在 5 个月以下时基本不会发病，但是对自身的蛋白仍然有潜在的排

7、斥反应。 免疫佐剂： 这一个方向在近十几年以来倒是发展得很快。 最开始的时候 Sigma 的弗氏 完全佐剂和不完全佐剂一直是黄金组合（铝盐佐剂也用得比较多），但是后来人们发现 CFA/IFA 毛病很多，诸如不利于动物健康、刺激免疫应答周期过长等等，于是各种新式佐剂 层出不穷，几乎每家试剂公司都有自己独特的佐剂。而且有效成份也多种多样，如脂质体， CpG，细胞因子，分子伴侣，特殊化学药物（如左旋咪唑）， 细菌或病毒的全部组份或部份 （如 LPS，肽聚糖），甚至还有一些是中草药提取物（如蜂胶、皂甙，当归多糖） 在 形式上， 大部份还是延用了 CFA/IFA 的油乳性质， 但是这两年来免乳化佐剂在国

8、内发展比较 快， 如我们现在使用的 Quickantibody 就是， 武汉这边还有另一个产品叫赛弗诺的也与其类 似，同时这些新型的佐剂对抗原的使用量要求很低，而且免疫周期也短，所以比较受欢迎， 毛病是商家对机理保密，用户无法获知其可能潜在缺点。 总之最后就变成了一种根据个人 喜好而选择的产品。 当然另外还有人说佐剂不是必须的，不加佐剂也可以免疫得不错，站 长自己没尝试过。 免疫部位： 这个没什么好说的了， 也基本上是根据喜好来的， 皮下、 腹腔、 脾内、 肌肉、 腋下、脚垫、静脉，各种地方免疫都说得过去，而且大家都能成功，所以这个就没什么好选 择的了，不过大部份人还是认为皮下是最有效的，因为

9、皮下含有大量的 DC 细胞，而 DC 细胞 是重要的 APC。 这里需要提出的是有一种叫作 RIMMS 的免疫方式极少人用到，但是据说效 果不错。 RIMMS 即多位点重复免疫（repetitive immunizations multiple sites），意思 是在相同的地方低剂量短间隔重复免疫， 一般是在小鼠背上皮下选择四五个点， 每三天左右 在这些点进行低剂量免疫，一般十几天就可以完成免疫。 大家可以看这篇文献：Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS 和这篇：Shorter deve

10、lopment of immunoassay for drugs application of the novel RIMMS technique enables rapid production of monoclonal antibodies to ranitidine， 不过成功的实例 中，很多人都是取小鼠的淋巴结而非脾脏进行融合的，淋巴结不好取啊。 免疫周期和间隔： 大部份人基本都同意免疫周期和免疫间隔尽量长一点比较好，这样 得到的抗体亲和力更高（除了上述的 RIMMS 外）。 甚至有人打完第一针后，再过九个月才 打第二针的，作者说效果很好，这个方法显然不适合大规模免疫，不然动物管理的

11、压力咱们 是承受不起的。另外，一些新型的佐剂则强调短周期也可以得到高亲和力的抗体的， 市场 上有很多佐剂宣称两周内即可完成免疫并得到高效价的血清的， 实在是太快了。 另外最近有 文献还对白天免疫动物还是晚上免疫动物更好这一问题作出了探讨，比如这篇：The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity ， 作者认为一些调控免疫的分子也有生物节律性， 它们的表达水生是跟随生物钟 有规律变化的， 在这些调节分子表达水平比较高的时候进行免疫或许可以得到更好的免疫效 果。 另外还有体

12、外免疫的， 即把脾脏从正常小鼠体内取出无菌培养， 直接向培养基中添加抗 原。 这种方法成功例子也非常多，毛病在于很难得到高亲和力的抗体，几乎所有的抗体都 是 IgM 亚型的， 不过也有少数人踩狗屎运得到其它亚型的情况。 这种免疫方式可能更多地用 于很难免疫成功的抗原， 特别是小鼠自身抗原的单抗的制备， 比如说要制备抗小鼠白蛋白的 单抗神马的，可以看看这篇文章：In vitro immunization effect of growth and differentiation factors on antigen-specific b cell activation and production

13、 of monoclonal antibodies to autologous antigens and weak immunogen。只当是一种备用 方案了。 这一部份说得有点分散，就这样结束吧。 细胞融合细胞融合 骨髓瘤细胞： 现在用的大多骨髓瘤细胞还是 HGPRT-的， Epitomics 公司用的兔子骨髓 瘤细胞也是 HGPRT-的， 也有极少人在科研中用 TK-的骨髓瘤，在其它物种身上得到的骨髓 瘤细胞也大多是 HGPRT-的 （因为 HGPRT 基因位于 X 染色体上， 容易获得突变株） 。 目前 sp2/0 细胞株是用得最多的小鼠骨髓瘤，但是用 FO、NS0 或 NS1 的也不少

14、， 其中 NS0 和 NS1 出现 比 SP2/0 略早， 估计现在使用它们的人估计都是老革命了， 而且它们还有一个毛病就是它们 可以合成抗体的 kappa 链，不过不分泌出来； FO 细胞则是 SP2/0 细胞亚克隆筛选得到的， 染色体和 SP2/0 一样也是 72 条， 它的特点在于其生长速度非常非常快， 在含优质血清的培 养基中，SP2/0 的倍增时间大约为 15 小时以上，但是 FO 的倍增时间经常只有七八个小时， 所以养起来就容易多了。 融合的介导： 这个 30 年来基本没什么改进，化学法主流 PEG，另外少数人用电融合， 其中 PEG 介导融合操作方便，成本低，稍作优化基本可以满足

15、绝大多数人的需求，其它的方 法如病毒法、激光法等基本上只在基础研究实验室里用，真正做单抗的用得不多。值得一提 的是一种基于微流控芯片的细胞融合技术， 本来微流控芯片在最近十年左右的时间里研究得 相当火热，但是能应用到细胞融合上还是相当有创意的，为了表示敬仰，我把这个稍稍说详 细点： 一般的细胞融合中，目的融合子是 AB 型的，但是通常会得到大量的 AA，BB 这样的 融合子，而且融合时 AA 和 BB 细胞自身靠得更近，所以真正能形成 AB 融合子的细胞是非常 少的，Voldman 等在 Microfluidic Control of Cell Pairing and Fusion 一文中介绍

16、了一 种微流控芯片，将 A 细胞通过此芯片，A 细胞则被捕获在芯片上的小杯中（此小杯只能容一 个细胞），再用反向的液流逆向冲刷细胞，则 A 细胞从原来的小杯掉到背向的大杯里（大杯 可以容两个细胞），经过这一步后，大杯里基本上满足一杯一个 A 细胞，然后再将 B 细胞流 过大杯而被大杯捕获， 那么最终的结果就是一个大杯里有一个 A 细胞和一个 B 细胞， 最后再 融合它们，据说这个方法可以使 50%左右的脾脏细胞参与融合，而我们现有的融合方法只有 不到 0.1%的脾脏细胞参与融合，可以想象此方法效率多高！ 不过需要指出的是，如果我们 用这个办法做融合，我们将得到很多很多克隆，以至于完全没有精力做筛选。 在制备传统单抗的同时， 还有人想制备出双特异性单抗， 即制备出来的单抗可以同时识 别两个表位， 其方法是用我们普通的方法制备出识别一个表位的杂交瘤， 然后将此杂交瘤再 一次诱变成 HGPRT-的细胞，将此细胞作为瘤细胞再与免疫了第二种表位抗原的小鼠脾脏细 胞融合，最后得到的单抗即可以识别含第一种表位的抗原，也能识别含第二种表位的抗原。 在我看来这个事情被他们搞复杂了， 直接