生物制片显微绘图染色体和核型分析技术.

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1、生物实验技术 2010级硕士研究生 第一章 生物制片技术 石蜡制片法 一、石蜡制片法 o 石蜡制片法是生物学的基本实验技术之一。要 完整的观察植（动）物的内部构造，必须先将实验 样品制成显微标本片，许多植物药材用徒手切片或 滑动切片法往往不易得到较薄且均匀的切片，因此 ，常采用石蜡切片法。 o原理：将液体石蜡渗透到样品材料内部，待石蜡凝 固成固体，再进行切片，所得切片薄而均匀，约厚 45m。有利于切片的长期保存和常规检查。 实验仪器、材料与试剂 实验仪器：石蜡切片机、切片刀、小木块（ 2.521.5cm）、解剖针、刀片、毛笔、 酒精灯、培养箱、显微镜等。 实验材料：徐长卿根等 实验试剂：F.A

2、.A.固定液、酒精、二甲苯、石 蜡、甘油蛋白、番红染色剂、固绿（亮绿） 染色剂等 实验步骤 o取 材 FAA固定 冲洗 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片 黏片 脱蜡 染色 透明 封藏 水 梯度乙醇 二甲苯 二甲苯+石蜡 蛋白胶 梯度乙醇 纯蜡 梯度乙醇 二甲苯 树脂 实验关键 1、取材：取材要有代表性，注意取材的时间、部 位和方向。 2、固定：F.A.A.固定液（F=福尔马林：40%甲醛 5ml；A=乙醇50%或70%90ml；A=冰醋酸 5ml），固定时间：1024h以上。 3、脱水（上行）：将材料用梯度乙醇（30%、 40%、50%（可过夜）、60%、70%（可过 夜）、80%、90%、100

3、%）脱水至100%乙 醇的过程。 4、透明：二甲苯（50%etoh+50%px、70%、 100%、100%）透明至完全透明。 5、浸蜡：将液体石蜡（熔点：5255）逐级浸入细胞中。 6、包埋：使处理后的材料包埋于石蜡中，待冷却后便于固定 于切片机上，进行切片。 7、切片：修整切片，固定蜡块于切片机上，进行切片。 8、粘片：用蛋白黏合剂将蜡片粘在载玻片上。 9、脱蜡：用二甲苯将蜡片中的蜡溶解脱去。 10、染色（下行） ：用梯度乙醇将溶液逐步过度到染色剂的 浓度。 （ 100% 95% 染亮绿试剂 80% 、70% 、 60% 、 50%（可过夜）、 40%、 30% 染番红色 ） 11、脱水透

4、明（上行）：用梯度乙醇将溶液逐步过度到无水状 态。 （30%、40%、50%（可过夜）、60%、70%（ 可过夜）、80%、90%、100%、50%ETOH+50%PX 、100%PX） 12、封片：树脂封片 二、冰冻制片法 o冰冻切片 o是借助低温冷冻将活体组织或新鲜组织快速 冻结达到一定的硬度进行制片的一种方法。 可省去包埋过程中的一切繁杂手续和时间能 够得到迅速的切片和显微鉴定结果。如手术 中等待冰冻快速病理报告，以病变性质而决 定手术方式和范围。 仪器：冰冻切片机、切片刀、二氧化碳、低温 冰箱等 试剂：甲醛、二氧化碳、苏木精染色液等 o操作步骤： 样品 冰冻 二氧化碳 切片 染色 封片

5、 冰冻切片机 苏木精染色 脱水、透明 冰冻切片的优缺点： （一）优点： 1简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等 手续即可进行切片，减少了一些中间环节。 2快速，用时短。 3组织变化不大。 4能很好保存脂肪，类脂等成分。 5能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对 于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜 表面抗原和水解酶保存较好。 （二）缺点： 1不容易做连续切片。 2切取的组织不能过大，组织过大不容易冻 结或者组织冻结不均，影响切片及染色效 果。 3不容易制作较薄的切片。 4组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而 影响细胞的形态结构及抗原物质的定位， 并且组织结构也不如石

6、蜡切片清晰。 冰冻切片机的使用及注意事项 （1）新鲜的组织制备 组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用 的骤冷剂有： CO2气（78） 丙酮干冰冷 却的轻石油醚、乙烷和庚烷（80） 液氮（ 190） 液氮冷却的丙烷（19）。液氮适 用于组织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂 。 （2）固定组织的制备 为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4、24 小时的甲醛固定能很好地保存酶类。但对许多脱氢 酶和转移酶能灭活。故不宜使用，低温，冷甲醛短 时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢 酶。 （3）恒冷箱温度 一般在冷冻后10分钟，到接近冷室温度时再切，一 般组织在1520切片最易

7、成功。每种组 织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度。 应根据经验总结。 （4）抗卷板 抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通 过。抗卷板略高于刀面的最高点。可凭经验调整 刀对组织的角度，一般新刀为20。 （5）切片机 操作程序：先接通电源，调定恒冷箱温度，调整切片 刀的角度，调定切片厚度，标本置载台致冷达所 需温度后，将其安放在切片机推进器上。即可切 片。 恒冷箱视使用情况每周或每月清洁一次冰霜 。 （6）切片刀 新刀切片满意，旧刀用自动磨刀机磨刀较好。 如果切片刀与抗卷板的位置，角度合乎要 求，又有一把锐利的刀，就能获得理想的 切片。 三、滑动切片法 滑走切片法（永久制片） （1

8、）水浸软化材料（如为鲜材料或固定材料 不用软化） （2）分割材料成适当大小。 （3）如为木质材料用甘油再软化 （4）把材料夹入滑走切片机的夹物部（如材 料小而不能夹入，可加辅助物，如石蜡泡 沫塑料等） （5）切片：调整1025u厚度，推动刀片 ，切下材料，用湿毛笔取下片子放表面皿 水中。 （6）经下列各级乙醇脱水 番红染色1-3分钟（50%乙醇配制） 50%乙醇（1-2次） 60%乙醇 70%乙醇 80%乙醇固绿染色2-5 秒 （90%醇配制） 90%乙醇（洗1-2 次）95%乙醇纯酒 精 注：以上操作于表面皿中进行，并用吸管及吸 水草纸吸净乙 醇液；每一级脱水时间3-5 分钟；并保证脱水足够

9、。 （7）经下列各级二甲苯透明 25%50%75%纯二甲苯。 注意：透明的每一级3-5分钟，用吸唧或吸水 草纸吸净试剂（注意勿吸去材料），再放入 下一级。到纯二甲苯如有混浊，须退回 95%酒精再脱水并重新按透明步骤进行。 （）封 片： 1、在玻片上滴一滴树脂，将片子平放在树胶 上，用镊子取盖玻片，使其一边接触树胶 缓慢盖下。 2、贴标签、写编号、名称（横切或纵切） 厚度、日期。 第二章 生物绘图与摄影技术 o第一节 显微绘图 显微绘图 1显微描绘器的使用 显微描绘器是用于描绘在显微镜下扩大的物象时所用的一种仪器。显 微描绘器利用两组光学系统将显微镜中的物象和图画的铅笔象相 迭合，同时送到观察者

10、的眼中，以利准确地依影描绘。 显微描绘器种类很多，下面介绍无柄描绘器： （1）构造和原理 描绘器是由两个三棱镜A、B粘合在一起，A棱镜地粘合面PP上，除 中央部位的小圆孔M外，均涂以水银；旁侧有一反射棱镜C，与 垂直方向成75角，其底面FF上亦涂以水银。D为接目镜，E为 接物镜。观察时，载玻片上物体的物象经接物镜E，接目镜D， 并通过两个三棱镜粘合面PP的中央小孔M而达于眼，同时绘图 板G上的铅笔H，也经C棱镜底面FF反射至PP平面而达于眼。 这样，眼睛能同时看到显微镜下的物体和绘图板上的铅笔，进行 描绘。 （2）使用方法： 将显微镜正放于绘图板的左方，按常规放置 标本片，调节，使物象清晰。

11、取下接目镜，在镜筒上端装上描绘器的附着 器，放回接目镜，再套上描绘器。 将绘图纸固定在绘图板上，调节绘图板的倾 斜度，使与描绘器的角度相一致，再调节光 线，使视野中的物象与铅笔象均清晰，就可 进行描绘。 （3）描绘方法 先描出目的物的图像轮廓，再描绘明显的特征，如较 大的纹孔、较粗的层纹等。当描绘一个视野容纳不 下的大形或长形物象时，可以先描绘一个视野，然 后微微移动标本片，再描绘连续的部分，须注意， 移动前，要确定23个明显的标志，以免移动后 物象与图像衔接不上。移动标本片和图纸要平行进 行，每次移动距离不应超过2/3个视野。描出草图 后，卸除描绘器，再仔细观察目的物，并与图像核 对，作进一

12、步的加工修整和补充必要的细节，成为 铅笔图。然后可根据需要再用硫酸纸依样描绘成墨 线图。 （4）描图像的放大倍数计算和调整常见的两种方法 把镜台量尺的刻度线通过描绘器描绘在图纸上（一般画大 格线，放大倍数很高时用小格线），用量尺测量绘出的两 刻度线之间的长度，除以镜台量尺两刻度线之间的实际长 度，即得图像的放大倍数。 如：图纸上两刻度线之间的长度为10mm，而镜台量尺该刻 度线间的实际长度为0.1mm，放大倍数100.1 100（倍） 也可直接用绘出得标尺表示放大倍数。 用目镜量尺测得物体的长度或大小，除绘图纸上物象在同 一方向测得得长度、大小，即得图像放大倍数。 如：大黄簇晶在图纸上绘得直径

13、为24mm，而在显微镜下得 实际长度为120m（0.12mm），放大倍数 240.12200（倍） 放大倍数的调整，一般可利用伸缩显微镜镜筒或调整绘图纸 的高低，使放大倍数成为整齐数字，调整合适，保持显微 镜、描绘器、绘图纸的位置不变，即可描绘。 注意：描绘图像的放大倍数是借助显微量尺和直尺计算而得 ，切不可将显微镜本身的放大倍数误认为是物象的放大倍 数。 自动显微成像系统 投影式描绘器 （5）新型显微描绘器介绍 绘图技巧简介 观察仔细是前提， 先绘草图和比例， 正确使用好纸笔， 保持规范和清晰， 真实准确是第一。 2药材组织简图绘制法 采用一定的图案符号（图12），来表示药材切面中各种组织即

14、某 些特殊构造的层次和分布范围，这种组织图，称之组织简图。 绘制方法如下： （1）制作标本片 制作反差较大的标本片，如各种二重、三重染色 的石蜡切片，经间苯三酚-浓盐酸、氯化锌碘液或其他试剂染色 后的手切片，要求组织结构清晰，界限分明。 （2）观察 描绘前，需要仔细观察标本片，熟悉切片中各种组织的 构造层次，重要鉴别特征的位置、各种组织所占的比例等。 （3）勾画轮廓图 用幻灯机或投影仪，将标本片投像于绘图纸上 ，调整合适的放大倍数，用3H（2H）铅笔轻轻勾画出各个部 位的轮廓，不清晰的部位在显微镜下，用显微测量加以校正。 小型材料，可以直接用描绘器进行勾画。徒手勾画法。 （4）修正铅笔图 用H

15、B型铅笔修正上述轮廓图，将 各部位即重要特征，分别用规定的简图符号细心 地描绘成铅笔图。 （5）图注及图名 简图绘完后，用整齐的引线将各 部位依次向右方或上、下方（叶类中药）引出， 写上图注，图下方写上图的名称并注明放大倍数 。 （6）注意事项 绘简图符号时，应注意线条的平 直和圆顺，点应均匀圆正，色调一致。简图是 平面图，不应绘出立体感，所有部位均用符号表 示，不应把某个部位绘成详图。简图一般要求 整体性和全面性，但有的药材也可只绘局部或主 要部位。 3药材组织详图绘制法 组织详图是把组织中各种细胞，由外向内一次 绘出的组织图。绘制方法如下： （1）、（2）项同组织简图绘制法。 （3）勾画轮

16、廓图 利用描绘器观察绘图，或显微照相后依次放大 的照片绘图。先用3H铅笔绘出草图。直径较 小的组织可全部绘出，直径大的组织可由外 向内分成数段，选取最有鉴别意义的组织特 征描绘。描绘时，各段及各部位细胞的放大 倍数应一致，各种细胞及内含物等应依次准 确绘出，切忌随意填充。 （4）详图中各类细胞的表示法及各种类型铅笔的使用： 各类细胞的表示法一般有三种： a.单线条法：适用于薄壁细胞。b.双线条法：适用于略增厚壁的细胞 。c.三线条法：适用于成群的厚壁细胞及导管；如单个散在时， 采用双线条法。 B、HB铅笔：适于绘粗线条。如绘厚壁细胞、导管的外缘线。 H、2H铅笔：适于绘中线条。如绘薄壁细胞，各种结晶体、淀粉粒等 。 3H铅笔：适于绘细线条。如绘厚壁细胞、导管的内缘线、层纹、纹 孔等。 （5）修正铅笔图 将勾画的轮廓图用不同型号（硬度）的铅笔和（4）项中规定的画法 修整成铅