白血病分子诊断技术咸阳资料

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1、白血病分子诊断技术 康圣环球医学特检集团 周 荣 WH0血液肿瘤分类方案（1999年 ） v 新分类方案的基本原则是：结合形态学、免疫表型、遗传改变和 临床特征来鉴定疾病的“真实本质”。 v 提供了疾病分类与治疗选择和预后判断的较明确关联性，开启了 血液肿瘤靶向性治疗和个性化方案的新时代。 形态学 免疫学 细胞遗传学 WH0血液肿瘤分类方案（2008年 ） 组织 蛋白 细胞 基因 白血病分子诊断的意义 精确诊断 准确预后 指导治疗 科研资料 白血病初发 MICM诊断 系统诊断异常标记 残留监测靶向治疗 WHO血液肿瘤新分类实验技术平台 实施WHO血液肿瘤新分类方案 高度依赖流式细胞、细胞遗传和

2、分子 生物学实验技术平台以及更为重要的 掌握这类实验技能并具有血液肿瘤专 业知识的血液病理学医师。 遗传工作站 流式细胞 基因平台 基因检测 融合基因 基因突变 “二次打击”学说 D.Gary Gilliland Best Practice 16:409-417 基因突变 融合基因 白血病发生 CML Indications for Diagnostic Tests Milestones and Monitoring in Patients with CML Treated with Imatinib (2008 ASH Education Program Book p420) TestInd

3、ication Physical ExamDiagnosis/Staging Every three month until resolution of splenomegaly Suspected progression or resistance Complete Blood Count Diagnosis/Staging Every 1-2 weeks until blood count have stabilized, then at 6 weeks intervals Suspected progression or resistance Bone Marrow Karyotypin

4、gDiagnosis/Staging 6, 12, 18 months or until complete cytogenetic response Suspected progression or resistance Quantitative PCR for Bcr-Abl Every three months once CCyR (complete cytogenetic response) documented FISH for BCR-ABL Uncertain Diagnosis (typical clinical presentation, but metaphase (peri

5、pheral blood)cytogenetics not successful, or Ph chromosome negative) Every 3 months if no access to high quantitative PCR monitoring Qualitative (low sensitivity) Uncertain Diagnosis (typical clinical presentation, but metaphase PCR for BCR-ABL cytogenetics not successful, or Ph chromosome negative)

6、 BCR-ABL Kinase Mutation Screen Suspected progression or resistance Molecular Measurements of Treatment Response Clinical Application (2008 ASH Education Program Book p367) Application Action Detect poor early treatment responseTreatment intensification Detect good early treatment responseTreatment

7、deintensification Detect relapseTreatment intensification Prepare for HSCT Measure MRD before HSCT Optimize timing of HSCT Measure MRD after HSCT Modulate immunosupression DLI, etc. Measure MRD at end of clinical trial Evaluate the result of novel anti- ALL agents or therapy 分子诊断在白血病诊断中的应用 提供早期辅助诊断及

8、预后判断 对治疗过程进行跟踪 进行白血病治疗后的微小残留检测 各病例中的具体应用 AML CML ALL CLL 淋巴瘤 AML病例中应用 t(8;21)(q22;q22) AML1-ETO t(15;17)(q22;q21) PML-RARa inv(16)( p13; q22) CBFB-MYH11 AML融合基因全套检测 FLT3基因突变检测 NPM1基因突变检测 c-kit/D816V突变检测 CEBPA基因突变检测 WT1基因表达定量检测 t(8;21)(q22;q22) AML1-ETO 融合基因 t(8;21)出现在大约7%的AML病例中，在年青的患者中更 为常见。其主要出现在A

9、ML-M2这一亚型中，大约有20 -40%的病例具有t(8;21)。 AML1-ETO 融合基因出现在所有的t(8;21)阳性的AML中 ，同时也出现在具有复杂易位的t(8;21)阴性的AML病例 中。 t(8;21)易位是一个较好的标志。 PML-RAR APL是一类临床凶险的急性白血病，常见广泛的 严重的出血，以颅内出血最为严重。 1、t （15;17)，是APL特有的遗传学标志。（70%-90% 的APL存在） 2、由于PML基因上融合位点的不同，分为bcr1(55%)、 bcr2(4%)、 bcr3(40%)三种融合型。 3、PML-RARa 融合基因（+）的患者，可使用全反式 维甲酸

10、并提示预后复发。该基因阳性的病人，可用于 疗效监测和微小残留的检测。 inv(16)( p13; q22) CBFB-MYH11融合基因 Inv(16)(p13;q22)或t(16;16)(p13;q22) 通常见于AML -M4Eo亚型，占总AML患者的10%。 inv(16)( p13; q22)的病人通常有较好的预后。 AML相关基因全套筛查 MLL/AF6MLL/AF9 MLL/AF10MLL/AF17 MLL/ELLdupMLL AML1/ETOPML/RARa PLZF/RARaNPM/RARa CBFB/MYH11NPM/MLF1 TLS/ERGDEK/CAN EVI1Hox11

11、 基因突变检测 AML 患者预后判断 C-Kit、FLT3、NPM1、CEBPA 染色体核型正常的AML患者 CEBPA (15%) Molecular Markers additional to cytogenetics with independent prognostic significances as regarding remission duration or survival in AML of adults AML: Challenge of Capturing Diesease Variety (2008 ASH Education Program Book p3) Pro

12、gnosisGene Gene mutation withCEPBAmut favorable impact NMP1mut but FLD3-ITDneg Gene mutation withKIT unfavorable impactFLD3-ITD but no NMP1mut MLL-PTD*(5-10% of normal karyotype AML) WT-1* * among normal karyotype AML 预后判断基因突变 好 CEBPA（+） FLT3（-）/NPM1（+） 差 FLT3（+）/NPM1（-） C-Kit（+） AML患者4种基因突变检测小结 WT1

13、定量检测 MDS/AML监测指标 WT1基因在AML和MDS病人中经常异常高表达，与 AML和MDS的发生和进展，以及凶险判断，疗效跟踪 和预后复发判断有非常密切的关系。 通过定量PCR检测WT1的表达能够有助于AML和MDS 病人的风险判断，疗效跟踪和预后复发的判断。 WT1在正常标本和AML病例中的表达情况 正常骨髓 患者骨髓 基因检测 CMPD诊断 CMPD相关异常（外周血象、骨髓象） 阴性 阳性 JAK2基因突变 阴性 阳性 PV、ET、CMF HES/CEL、SM CML诊断可能 BCR/ABL融合基因（FISH、PCR） 在WHO2008分类系统中，将有无JAK2突变列为主要的诊断

14、指标： 如果JAK2突变阳性，血红蛋白增加，骨髓红系细胞明显增加，就可 以诊断真性红细胞增多症（PV），即使患者就诊时血红蛋白低于以往 WHO所规定的指标值，但却持续超过正常值20g/l，也可以确诊PV。 如果JAK2突变阳性，血小板仅仅持续大于450*109/L，骨髓巨核细胞 增生，可以诊断原发性血小板增多（ET）。 PV/ET诊断 FIP1L1-PDGFRA 部分高嗜酸性粒细胞综合征（HES）患者含有FIP1L1- PDGFRA融合基因，FIP1L1-PDGFRA有持续活化的酪 氨酸激酶活性，对酪氨酸激酶抑制剂非常敏感，可用格 列卫治疗。 ETV6-PDGFRB 有少部分CMPD病例（BC

15、R-ABL阴性）的PDGFRB基 因持续性活化表达，格列卫能够特异性的抑制ETV6- PDGFRB的酪氨酸激酶活性，携带该融合基因的CMPD 病例可以选择格列卫治疗。 CML病例中的应用 BCR-ABL融合基因检测： t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL p210 t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL p230 BCR-ABL融合基因ABL激酶突变检测 BCR-ABL融合基因 超过95%的CML病例中存在BCR-ABL融合基因 P210型 M-bcr（绝大多数） b3-a2（ 55% ） b2-a2（ 40% ） b3-a2和b2-a2 （ 5% ） b3-a3 （罕见

16、） b2-a3 （罕见） p230型 u-bcr e19-a2（罕见） 定性检测：RT-PCR 定量检测：QRT-PCR 定性检测报告模板 定量检测报告 BCR-ABL融合基因ABL激酶突变检测 ABL激酶突变会引起伊马替尼治疗耐药 T315I 耐药机制: T315突变后不能与伊马替尼形成关键性的氢 键，可完全阻断伊马替尼与ABL激酶区的结合,从而耐药 。 P环的突变(244-255) 耐药机制：如 Y253FH、E255KV、Q252H、 G250E等通过改变ABL激酶的空间构象，亦可阻碍伊马 替尼与之结合。 A环突变(381-402) 一般提高用药量可以降低耐药程度。 其它突变 对于耐药程度较弱的突变，如M244V、G250E、 F317L、E355G、F359V及V379I等，通过提高药 物剂量，可以克服耐药。 报告模板 ALL病例中应用 t(1;19)