放线菌新种分类鉴定教材

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1、放线菌新种分离鉴定 1 实验目的 2 实验方法 3 实验结果 4 总结 2011/12/281 1、实验目的 2011/12/282 本实验通过对分离得到的放线菌新种从形 态学、生理生化反应特征、和分子遗传分类学方面进 行鉴定，证明其是以前从未发现的新种。 2、实验方法 2.1 分离方法 2.3 鉴定方法 表观观特征 化学分类类 基因型分类类 2011/12/283 2.2 16SrRNA基因序列测定 2.1 分离方法 2011/12/284 近年来出现了胞外多糖胶与动孢溶液相结合的分离方法、再水化-离 心 法、极高频辐射法、噬菌体定向分离法和蔗糖梯度离心法等用于 稀有放线菌选择性分离的方法。

2、 2011/12/285 2.2 16SrRNA基因序列测定 放线菌基因组的提取 16SrRNA基因扩增 胶回收 连接 转化 测序研究 A 电镜观察 B 培养特征 C生理生化特征 2011/12/286 2.3.1 表观特征 A. 电镜 取菌体后,3%戊二醛固定4h, 0.1M磷酸缓冲液漂洗。 酒精梯度脱水，在30%、50、70、80%、100依次脱 水，其中100酒精2次，每次10min。 乙酸异戊脂置换，50%一次，100%两次。 Eiko公司XD-1型二氧化碳临界点干燥器干燥，Eiko公司IB-3 型离子镀金仪喷金镀膜。 JEOL公司JSM-840扫描电镜观察。 2011/12/287

3、B. 培养特征 参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培养特征描述所 采用的标准培养基进行培养特征测定。 所用培养基有:ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏琼 脂、马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂，平板接种，28培 养7，14，21，28d后分别观察并记录基内菌丝、气生 菌丝的生长情况及可溶性色素。 2011/12/288 C. 生理生化实验 生理生化特性的测定主要包括: pH、盐浓度和温度耐受性，明胶液化，淀粉水解，脲酶 的产生，牛奶胨化和凝固，硝酸盐还原，H2S的产生，黑 色素的产生，唯一碳、氮源利用等试验。 2011/12/289 a. pH、盐浓度和温度耐受性 upH耐受实验 在高氏一号培养

4、基中分别加入pH缓冲液，空白培养基作阴性对照，28 培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。 u温度耐受实验 将菌株接种在高氏一号培养基上，分别在4、10 、16 、20 、 28、37、45培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。 u盐耐受实验 高氏一号培养基内加入不同浓度的NaCI(l%，3%，5%，7%，10%，15% ，20%)28培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。 2011/12/2810 b. 明胶液化 取明胶培养基试管作穿刺接种，另有两支不接种作空白 对照。于28C培养箱中培养。 培养2、7、10、14和30天的试管，放入4C冰箱或置于冷 水中30min，然后进行观察。 如

5、明胶凝块部分或全部变为可流通的液体，则明胶水解 阳性。 如明胶凝块呈固体，则明胶水解阴性。 若菌体未生长，可能是不能在明胶培养基上生长。 2011/12/2811 c. 淀粉水解 将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生长良好时， 在菌落周围滴加碘液检测淀粉水解酶活性的强弱。 滴加碘液后培养皿背景呈蓝黑色,菌落四周若不变色 ，或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培养基仍不变 色，表示淀粉水解阴性；若变成透明无色则为阳性， 说明产生淀粉酶水解淀粉。 2011/12/2812 d. 脲酶的产生 e. 牛奶凝固与胨化 将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，观察牛奶凝固与胨化现象。 若牛奶有凝块则为凝固，继续培养，凝

6、固后有液体出现，进一步水解 成液体，则为胨化，一般先凝固后胨化。 有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变 为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存 在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。 挑取1824h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培 养14d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红色 为阳性。 2011/12/2813 将待测菌种接在硝酸盐液体培养基中，置室温下培养，1 、3、5d取样测定。每株菌作复本，另两管作对照。 培养液中加入格里氏试剂A、B液各一滴，如呈现粉红色、 玫瑰红色，表明硝酸盐还原阳性，如

7、无红色出现，则加1， 2滴二苯胺试剂，如呈蓝色，表示培养液中仍有硝酸盐存在 ，硝酸盐还原属阴性，若不呈蓝色，表示硝酸盐和亚硝酸 盐都已还原成其他物质，仍按阳性结果处理。 f. 硝酸盐还原试验 2011/12/2814 g. H2S的产生 某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而产生硫化氢气 体，若于培养基中加入柠檬酸铁铵或醋酸铵，则与硫化氢作用生 成硫化亚铁或硫化铅（黑色）沉淀。 h. 黑色素的产生 将供试菌株接种在酪氨酸培养基斜面管上，培养 7 d 和 14 d 观察 结果，培养基被染成褐色或者黑色即说明该菌产生黑色素。 2011/12/2815 i. 碳源利用和氮源利用（本实验利用BI

8、OLOG板） 碳源：D-葡萄糖，蔗糖，L-树胶醛糖，D-果糖，D-木糖，鼠李糖，I- 肌醇，棉子糖，D-甘露醇，纤维素。 不加碳源的基础培养基作为阴性对照。 氮源: KNO3，NaNO2，尿素， (NH4)2SO4，丝氨酸，烟酰胺，酪氨酸 ， DL-天冬氨酸，L-甲硫氨酸，DL-丙氨酸，L-精氨酸，L(+)-谷氨酸 ，甘氨酸，L-苯丙氨酸，腺嘌呤。 不同氮源按0.5%的浓度加入，培15天后，将各种氮源上的生长状况与 不加氮源的基础培养基上的生长状况作比较。 2011/12/2816 A 细胞壁化学组分 B 磷酸类脂测定 C 甲基萘醌测定 D 脂肪酸测定 2011/12/2817 2.3.2 化

9、学分类 A.细胞壁化学组分 放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，根据肽聚糖分 子中肽链第3位氨基酸的种类，种间肽桥和邻近的四 肽交联的位置来决定放线菌细胞壁型的划分。 Lechevalier等（1976）根据放线菌细胞壁的化学组 分和全细胞水解液糖型，将放线菌归为9个主要类群 和4个糖型。 2011/12/2818 胞壁类类型主要组组成代表属 IL,L-DAP，甘氨酸Sterptomyces IIMeso-DAP，甘氨酸Micromonospora IIIMeso-DAPActinomadura IVMeso-DAP，阿拉伯糖，半乳糖Nocardia V赖赖氨酸，鸟鸟氨酸Actinomyces V

10、I赖赖氨酸（天冬氨酸，半乳糖）Oerskovia VIIDAB，甘氨酸Agromyces VIII鸟鸟氨酸Bifidobacterium IXMeso-DAP， 多种氨基酸Mycoplana 放线菌细胞壁的主要构成（Lechevalier，1976 ） 2011/12/2819 糖类类型主要成分代表属、种 A阿拉伯糖，半乳糖Nocardia B马马杜拉糖Actinomadura C无特征性糖Streptomyces D木糖，阿拉伯糖Micromonospora E半乳糖Kutzneria viridogriseum 放线菌全细胞的主要糖类型（Lechevalier，1976 ） 2011/12

11、/2820 全细胞TLC分析实验流程： 全细细胞糖分析 菌体培养与收集 细细胞水解 （0.1ml 0.5mol/L HCl） 点样样 （0.6-0.8l水解液和1% 的标标准糖液） 层层析 显显色 （苯胺邻邻苯二甲酸试剂试剂 ） 氨基酸分析 菌体培养与收集 细细胞水解 （0.1ml 6mol/L HCl） 点样样 （氨基酸水解样样品0.4l 和0.01mol/L标标准氨基酸 混合液0.2l） 层层析 显显色 （0.4%茚茚三酮试剂酮试剂 ） 2011/12/2821 磷酸类脂位于放线菌细胞膜上，属于极性脂。不同属菌的磷酸类脂 组份是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分类项目中不可 缺少的

12、分类指征。磷酸类脂的种类繁多，但用于分类的指征并不多。 用于分类指征的磷酸类脂只有五种： 磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine,PE） 磷脂酰甲基乙醇胺（phosphatidyl methyl ethanolamine,PME） 磷脂酰胆碱（phosphatidyl choline, PC） 磷脂酰甘油（phosphatidyl glycerol ,PG） 含葡萄糖胺的未知结构磷酸类脂（phospholipids of unknown structure containing glucosamine, GluNu） B. 磷酸类脂测定 2011/12/2822 称取

13、1g湿菌体于带螺口的40 ml离心管中。 加入15ml甲醇。 100水浴10 min，自然冷却。 加入10 ml氯仿和6 ml 0.5%NaCl。 用力摇匀10 min，静止可看到分层。 8000 rpm，离心10 min。 到入分液漏斗静止分层，取下层。 30-40旋转蒸干。 分两次各加入200l氯仿/甲醇（2:1）冲洗器壁。 液体移入EP管（约100-200l）,8000 rpm，离心10 min，去沉淀。 4保存备用。 细胞磷脂的提取 2011/12/2823 点样样 （距离底边边2*2cm，点样样10l，溶剂剂前沿1cm） 展层层 （展层层液：第一层层： 氯氯仿:甲醇:水=65:25:

14、4 第二层层: 氯氯仿:甲醇:乙酸:水=80:12:15:4 ） 显显色 （6种显显色剂剂） 实验流程： 2011/12/2824 C. 甲基萘醌测定 2011/12/2825 大多数细菌含有甲基萘醌或泛醌，或两者均有。包括 放线菌在内的革兰氏阳性细菌只含甲基萘醌。 放线菌及有冠军的甲基萘醌异戊烯侧链长度和氢饱和 度变化相当大，多为部分饱和，含有7-12个异戊烯单 位。 放线菌目中不同菌属的甲基萘醌类型如下表所示。 2011/12/2826 放线菌目中甲基萘醌类型 类类型萘醌萘醌 种类类 Eubacteria （异戊烯单烯单 位无氢氢化） I aMK-7 Bmk-9 Mycobacterium

15、 （主要是8或9个异戊烯烯 单单位上被2或4个氢氢化） II aMK-8(H2) bMK-8(H4) cMK-9(H2) dMK-9(H4) Saccharomonospora （4氢氢化的多烯萘醌烯萘醌 ） III aMK-8(H4), MK-9(H4) bMK-9(H4),MK-10(H4) Streptomyces （具有同一链长链长 ，但氢氢 饱饱和度不同的萘醌萘醌 ） IV aMK-9(H2), MK-9(H4),MK-9(H6) bMK-9(H4), MK-9(H6),MK-9(H8) cMK-10(H4),MK-9(H6) 菌体的收集制备 待测菌株用液体培养基培养，离心收集菌体，

16、用蒸馏 水洗涤两次，菌体于-80冷冻3d，冷冻干燥机抽干菌 体，冻干菌体4干燥器保存备用。 醌的提取及纯化 2011/12/2827 D. 脂肪酸测定 放线菌细胞中脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团具有 分类学意义，是一项重要的分类特征。 脂肪酸组份一般较为复杂，分别归属3种类型： 直链饱和与不饱和、分枝和复杂形式的脂肪酸。 脂肪酸分析应在标准化的条件下进行，因为不同组分的相对含 量因菌龄和培养条件的不同而异。 脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分析 可为种和亚种分类提供有用的基本资料。 2011/12/2828 2.2.3 基因型分类 A G+C%含量分析 B DNA-DNA分子杂交 C 16srRNA基因序列分析及进化树