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1、北京中医药大学 硕士学位论文 朱砂根总皂苷抗癌作用及作用机理研究 姓名：沈欣 申请学位级别：硕士 专业：中西医结合基础（中药药理学） 指导教师：孙建宁 20031001 史室擅耍 一 一二圣 中文摘要 朱砂根总皂苷抗癌作用及作用机理研究 恶性肿瘤( m a li g n a n tt u m o r ) 是目前危害人类健康的主要疾病之一，其 特征为异常细胞的失控生长，并由原发部位向它处播散，这种播散如无法控制， 将侵犯要害器官和引起衰竭，最后导致死亡。其死亡率之高，已成为人类死亡 原因的第一位或第二位，为此，癌症的防治和研究正成为垒世界日益关注的课 题。 现阶段中医防治肿瘤工作已有很大进展，不
2、仅表现在临床疗效的提高， 诊治手段的多样化，还体现在理论实验研究的深入，从而挖掘了中医药所蕴藏 的科学内涵，用现代理论阐明了中医药治疗机理，使中医药抗癌步入了一个新 的阶段。 从中草药中提取有效成分进行抗癌研究，是近年来中医药研究的又一个 切入点，并取得了很多成绩。通过和现代医学理论的结合，中药有效成分低毒 高效、多途径、多样性的特点得到了进一步的论述。如何挖掘中医药宝库并对 中药有效成分进行机理性的研究，以利于开发和临床是科研人员的当务之急。 中药朱砂根( 紫金牛科朱砂根A r d i s i ac r e n a t aS i m s ) 始载于本草纲 目，分布于我国浙江、江西、贵州等地区
3、，被当地多种药志所收载，是一个 资源丰富，分布广泛，有临床特效的中草药，八十年代，我研究所抗肿瘤小组 在总结民间用药经验的基础上，进行了全面筛选，从中发现朱砂根提取物有明 显的抗肿瘤活性，经过多年的研究，已取得了大量的科研成果。 本课题是我所多年来的所进行的朱砂根抗肿瘤活性成分研究课题中一部 分，我们通过从朱砂根中提取分离出多种成分，包括皂苷类、香豆素类：矮地茶 素( 岩白菜素) 、去甲矮地茶素、1 1 O 一丁香酰矮地茶素以及密花醌、B 一谷甾醇、 胡萝p 苷等进行筛选试验。经药理学研究证明朱砂根皂苷A ( A r d i s i a c r i s p i nA ) 、 朱砂根皂苷B (
4、A r d i s i a c r is p i nB ) 、朱砂根新苷A ( A r d iS C f S f l O S i d eA ) 、朱砂根 新苷B ( A r d iS C - C N O S i d eB ) ，具有较强的抑制肿瘤生长活性，因此将其皂苷类成 分提取成为一个新的抗癌药物是我们主要研究目的，而本课题的主要内容是对朱 砂根有效成分进行了部分药效学研究和机理探讨。本课题的实验工作包括抑瘤实 皋矽鼹总皂彗抗癌捧弼敷作用规理研究 验和机理研究两部分，押瘤蜜验主要是在裸茕模溅上观察朱砂根总皂簪对移植性 肺癌和结肠癌的影响作用，以及对体外培养的人肺巨细胞癌( P G ) ，人肝
5、癌 ( E e l 一7 4 0 2 ) 、人鼻咽癌( K B ) 、人结肠癌( H C T ) 、人宫颈癌( H E L A ) 、人臼血病 ( H L 一6 0 ) 箨六辨癯拣细胞鲤生长嚣挣割作用；执理研究包括对入黔嚣翅戆癌 ( P G ) 、人翳臻( B e l - 7 4 0 2 ，、人崮盘病( H 卜6 ) 翅戆送行体羚囊戆掌磺突实验 和对小鼠细脆免疫的影响实骏。 1 、朱砂根总皂瞽对荷瘤裸鼠的影响 实验采用裸鼠，接种肺癌葶辩黠肠癌癯株，建立费瘤模型，以瘤体鬟鳖为指标 分鬟或察受浚药对嚣秀癯拣戆耱秘俸霜，著通过检测动穆矗赣爱壹亿撩禄髓察受 试药物的薅憔反应。结粟表明4 0 m g k
6、 g 朱砂根总皂瞽的抑瘤作用显著( P 3 天 4 天) 。环磷酸陂缀，赣| 买膏猝潮H L 一6 0 细筢活力酶作 用，O D 使减少，但抑制强度不如朱砂根总皂苷( 细胞生长抑制率最高为3 5 ) 。 朱砂裰悬毫瞢sHg m l ，基本不影酶正常艟L 细魏活力。泉砂撮总皂苷1 6 壮g m l ， 抑制H E L 细胞活力( 细胞生长抑制率可达5 2 ) ，与时间有一定相关性。( 表1 0 ) 震l o朱砂搬总皂苷对白血瘸H L 6 0 细胞增殖生长的影响 朱砂掇总皂苷各组与对照组比较，H E L + 朱砂搬总皂苷的两个鳃分别与H E L 对照组比较 P 0 0 5”P 0 ，o l 3 3
7、 直接恭伤癌细胞： 诗数板法，蠹接骨数髭酶癌缎施，结暴袭醒，餍束移裰葸皂蔷君l 。4 天，各朱砂 根总皂苷组死细胞数均明艋增( P O + 0 5 ) ，与荆量有较好的相关性，与时间也有较好 的正裙关。环硫酸胺组，菇细脆鼓毪晴显爝加( P o 0 5 ) ，与靖阈霄正枢关经。朱砂 根总皂苷8 “g m l 1 6 “g m l ，正常H E L 死细胞数量基本H E r 对照组相近。( 表1 1 ) 朱砂跟总皂苷抗癌作用及作用机理研究 朱砂根总皂苷对H L 6 0 和H E L 死细胞数的影响 ，、。 剂量死细胞数( 1 0 4 m 1 )死细胞百分比( ) u 州1 d 2 d3 d4 dl
8、 d2 d3 d4 d - - ，- - - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - - - - - - - - - - - - - - - - ，_ _ - - _ _ - _ _ ：_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。_ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ - - - - - - - - - _ _ 一- _ _ _ - _ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - _ - - - _ _ _ _ _ - - - _ - - - - - - - _ - _ - - _ - _ - - - -
9、 - - - - - - - - - - - - - - - _ - - - _ _ _ _ _ 。_ 。_ _ - - - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - - - - - - - - - _ - - - 一 H L - 6 0 对照组0 9 9 士1 0 8 l9 5 l7 25 4 1 = E 52 81 2 4 3 1 01 65 28 21 5 63 5 6 Z S 0 8 0 1 组1 0I 9 4 士114 8 7 - 4 6 66 2 5 68 61 12 l 士87 31 132 矗23 & 25 5 0 Z S G 啪组4 01 6 9 - 05 74 3 3
10、 - + - 2 2 86 3 4 + 2 鼯1 1 6 2 士8 0 51 0 11 9 84 156 4 _ 8 爱腓3 组8 0Z 6 3 1 1 l +6 3 3 蚂1 07 4 l 士2 1 21 2 船8 5 41 9 13 l75 637 75 z S 0 8 0 - 4 组1 002 3 7 工13 1 + 6 8 蝴2 41 0 4 6 e 2 4 71 45 8 毋2 02 5 47 46 3 28 0 8 Z S G - 8 0 - 5 组1 6 035 6 ：e 1 4 8 + 8 2 筒0 3 +9 9 1 3 A 31 48 8 1 0 5 31 6 95 6 76
11、 887 7 6 。园M Yl0Z 6 - t + 0 8 9 *6 5 啦。5 09 8 4 ：4 1 71 2 3 2 78 6 2 1 14 756 7 28 0 2 H E L 对照组35 2 24 2 5 i 0 7 83 3 8 士l3 026 3 l1 32 0 02 2 82 2 72 5 0 H E L + Z S 6 - S 0 d ,804 2 5 a ：0 7 82 8 8 0 5 73 5 0 n 8 726 3 12 53 8 63 3 83 683 28 旺L + Z S G - 8 0 太 1 6037 5 = 0 8 74 7 缸15 623 脚2 2 2 位
12、10 83 7 55 855 2 83 93 朱砂根总皂苷各组与H L - 6 0 对照组比较，H E L + 朱砂根总皂苷的两个组分别与 H E L 对照组比较+ P 0 0 5 3 4 干扰H L 6 0 细胞周期 流式细胞仪测定结果表明，用朱砂根总皂苷后l 天，各朱砂根总皂苷组， s l 、G 2 M T ( 变化幅度不大) ，G 1 影响不大。第2 天，G lt ( 除外低剂量) 、S l ( 除外低剂量) 、G 2 M 变化不大。第3 天，G 1 变化不大，Sl ( 朱砂根总皂苷 5 略高) ，G 2 Mt ( 朱砂根总皂苷略低) 。环磷酰胺组，第1 天，G l 略I 、SI 、 G
13、 2 Mt ；第2 天，G 1l 、s 略t 、G 2 M t ；第3 天，G 1 、S 、G 2 M 变化不大。( 表 1 2 ) 表1 2 朱砂根总皂苷对H L 一6 0 细胞周期各时相( 百分数) 的影响 Z S G - 8 0 - 1 组1 02 2 05 9 0 1 9 02 7 04 9 5 2 4 03 8 54 0 5 2 10 差三整岔寂黢耋塞受握整皇苴越姣鲮厶擅垂蟹旌生蓬盈蕉毫艘鹱癌 ：圭 Z S G - 8 秘2 短 Z S G 一8 0 - 3 组 Z S G 8 叫姐 Z S G 8 0 - 5 组 P G 十C T X 大荆量姐 3 5 诱导H L 6 0 细胞凋亡
14、： 流式麴胞仪结果表明，朱砂根总皂苷使H L 6 0 细胞凋亡发生率明盟增加。 周朱砂根总崽瞽l - 3 天，各朱砂根总皂蔷组，S u b ，G i 均升高，并量较好的剂量 一效应程关及时超载壤赖；基。Z S G - 8 0 5 鲤第3 天，S u b G ；达8 9 1 。繇磷酸跤 鲤，S u b G I 也明显增加，也裔时间依赖惶，S u b G 1 达7 6 8 ，诱辱镁度似乎 不如朱砂根总皂苷。( 表1 3 ) 表1 3Z S G 8 0 对H L 6 0 细胞形态学A P O 与流式细胞仪S u b G I 的影响 j 题荆董2 4 h r4 8 h r7 2 h r 弘撼l A P
15、 0 秘 S 涵G 1 A P O S u b G t 强 A P O S u b G l H l 一6 0 对照鳆506 05 ，01 831 91 6 1 Z S G 一8 0 - l 姐1 02 5 82 5 81 62 4 52 42 52 Z S G 8 0 2 组4 01 2 33 3 94 62 8 12 82 7 ；4 Z S G 一8 0 - 3 姐8 04 0 ，54 1 23 04 6 53 4 5 0 4 Z S G 8 0 4 组l O 04 0 54 4 84 96 0 53 06 9 7 Z S G 8 0 - 5 组 6 05 1 ，85 0 。84 76 2 + 23 88 9 ， H i 石0 + C T X 大弃I 量组 l 。2 3 83 7 g6 94 5 - l s 7 6 8 3 6 促进H L 一6 0 细胞凋亡的发嫩 荧竞影态学或察，显示 疆一6 0 鳃憨勇发生凋亡，瘸皋砂壤总皂著菇1 3 夭， 见凋亡特征魏细胞喷显增多，飑梭、胞膜呈典型盼凋亡特征，亦易见到较多教在 的凋亡小体。同时可见在凋亡熬础上发生坏死的细胞( 坏死型的凋亡细胞) ，即凋 亡和坏死共存于细胞内，该类型细胞愈来愈多，与剂照和时间有相关依赖性。A P O 计数表明，用朱砂根芯皂苷盛i o 天，各组A
