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1、分子生物学综述题目：DNA甲基化的研究方法与技术姓名： 班级： 学号： 摘要：DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。关键字：表观遗传学；DNA甲基化；甲基化研究方法1 导言早在1942年,C.H.Waddington首次提出表观遗传学 (epigenetics)的概念,并指出表观遗传与遗
2、传是相对的,它主要研究基因型和表型的关系。几十年后,霍利迪(R. Holiday)针对表观遗传学提出了更新的系统性论断，也就是人们现在比较统一的认识1，即在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达，这种修饰以DNA甲基化最为常见。其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱，即不同组织与疾病状态下，5-甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱，以指导和系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用2。DNA甲基化的研究，逐渐成为新的研究热点。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。让
3、我一一介绍现有的大部分DNA甲基化研究方法，并对其相关特性进行简要分析与总结。1.1 DNA甲基化及 CpG岛 DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5端的胞嘧啶转变为5甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达3。脊椎动物基因的甲基化状态有
4、三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体4。1.2 DNA 甲基化的生物学作用 1.2.1 DNA 甲基化与遗传印记、胚胎发育 DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的（Li 等1992年和Okano等1999年）3。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions,ICRs)所调控,该区域在双亲
5、中的一个等位基因是甲基化的4。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。如：脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等5。 1.2.2 DNA甲基化与肿瘤 甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高,从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)4和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率提高,例如：胰岛素样生长因子-2（IGF-2）基因印记
6、丢失导致多种肿瘤,如Wilms瘤6。13 DNA 甲基化的研究方法 近15年来，人们越来越认识到DNA甲基化研究的重要性，开发出一列检测DNA的方法。根据研究目的这些方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。根据研究所用处理方法不同可以分为：基于PCR 的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。2 甲基化研究方法学回顾2.1 基因组整体水平甲基化分析 2.1.1 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法 HPLC是一种比较传统的方法，能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。它由Kuo等1980年7首次报道
7、。过程是将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5mC/(5mC+5 C) 的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA甲基化的标准方法。但它需要较精密的仪器。Fraga等2002 年8运用高效毛细管电泳法(HPCE)处理DNA水解产物，以确定5mC 的水平。与HPLC相比，HPCE更加简便、快速、经济。HPLC及HPCE测定基因组整体DNA甲基化水平的敏感性均较高。Oefner 等1992年9提出变性高效液相色谱法（DHPLC）用于分析单核苷酸和DNA分子。邓大君等200110将其改进与PCR 联用建立了一种
8、检测甲基化程度的DHPLC分析方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增，由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞嘧啶，因此原甲基化的在PCR扩增时，其变性温度也相应上升，使PCR 产物在色谱柱中保留的时间明显延长，这样就可以测定出PCR 产物中甲基化的情况。这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示目的片段中所有CpG 位点甲基化的情况，但不能对甲基化的CpG 位点进行定位。2.1.2 SssI 甲基转移酶法11 SssI 甲基转移酶能够催化DNA的CpG 位点发生甲基化。3H-S- 腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)在SssI 甲基转移酶催化作用使基因组DNA的CpG
9、位点发生甲基化。通过测定剩余的放射性标记的SAM即可得到原基因组整体甲基化水平，即测到的放射性强度与所测DNA甲基化水平成反比。这种方法的缺点是所使用的SssI 甲基转移酶不稳定，致结果不够精确。 2.1.3 免疫化学法12 这种方法是基于单克隆抗体能够与5mC发生特异性反应。应用荧光素标记抗体使之与预先已固定在DEAE膜上的样品DNA特异性结合，对DEAE膜上的荧光素进行扫描得到5mC的水平，其荧光素强度与5mC水平成正比。Oakeley等1997年23报道了这种方法。这种方法需要精密的仪器。2.1.4 氯乙醛法 Oakeley等 1999年13首先描述了这种使用氯乙醛和荧光标记的方法。首先
10、，将DNA经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变（Frommer等1992年）14，然后经过银或色谱柱去除DNA链上的嘌呤，再将样品与氯乙醛共同孵育，这样5mC就转变为带有强荧光的乙烯胞嘧啶，荧光的强度与原5mC 的水平成正比。这种方法可以直接测定基因组整体5mC水平。其优点是所用试剂价格低廉且稳定性好，避免了放射性污染，但缺点是费时费力，而且氯乙醛是一种有毒的物质。随着甲基化研究的不断深入，甲基化分析技术将逐步完善。完善的研究技术将提供强有力的技术支持，从而为表观遗传、胚胎发育、基因印记及肿瘤研究提供一些新的思路。 参考文献： 1Wu C T, Morr
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