固定化酶和固定化细胞教材

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1、 知识点: 1.酶和活细胞的固定方法(包括游离酶、微生物、动 物细胞和植物细胞）。 2.辅酶和辅基的固定 。 3.固定化酶的性质 4.固定化对酶反应系统的影响 5.固定化酶和固定化细胞的应用 固定化酶固定化酶(Immobilized Enzyme(Immobilized Enzyme）是）是2020世纪世纪6060年代年代 发展起来的发展起来的项新技术项新技术。以往使用的酶绝大多数是水。以往使用的酶绝大多数是水 溶性的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因溶性的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因 而阻碍了酶工业的进一步发展。而阻碍了酶工业的进一步发展。6060年代后，在酶学研年代后，在

2、酶学研 究领域内涌现出固定化酶。究领域内涌现出固定化酶。它是通过物理的或化学的它是通过物理的或化学的 手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一 定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分 发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。 19711971年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶 的名称。的名称。 从从6060年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们 把注意

3、力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不 但固定化方法和载体开发有了长足发展，并且已转向但固定化方法和载体开发有了长足发展，并且已转向 它在工业、医药、化学分析、亲和层析、环境保护、它在工业、医药、化学分析、亲和层析、环境保护、 能源开发以及理论研究等方面的应用研究。能源开发以及理论研究等方面的应用研究。 1 酶和活细胞的固定方法 1.1 固定化酶与固定化细胞的优缺点 1.1.1固定化酶: 固定化酶的研究已取得大量重要成果发挥 着巨大作用，受到人们极大的关注。其重要原因是它和水溶性 酶比较具有以下优点： (1)极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶

4、液中没有酶的 残留，简化了提纯工艺. (2)可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道 化。 (3)酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化 。 (4)在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。 (5)较能适应于多酶反应。 (6)酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成 本低。 固定化酶也存在一些缺点： (1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成 本，使工厂开始投资大。 (2)比较适应水溶性底物和小分子底物。 (3)与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的 反应，同时对胞内酶需经分离后才能固定化。 1.1.2固定化细胞 固定化细胞是在固定化酶的基础上

5、发展起来 的。它的优点如下: (1)省去了酶的分离手续为多酶系统，无须辅因子再生。 (2)细胞生长快、而且多、反应快。 (3)可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分 离去细胞，能一边徘出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑 制和消耗。 (4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对 污染因子的抵抗力增加。 固定化细胞同时也存在些缺点： (1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影 响产品纯度。 (2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需 抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。 (3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。 1.2酶的固定化方法 酶的固定化方法有：吸附法

6、；共价键结合法；交联法；包埋法. 如下图: 1.2.1 吸附法 吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。 (1) 物理吸附法: 通过氢键、疏水作用和电子亲和力等物 理作用，将酶固定于水不溶载体上从而制成固定化酶。常 用的载体有： 有机载体。纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等 。比如用纤维索作为吸附剂，用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附 木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6磷酸葡萄糖脱氢酶。吸 附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg/cm2 。 无机载休。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二 氧化钛等。比如用多孔硅为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的r淀 粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45进行固定化，用高浓

7、度的 底物进行连续反应半衰期分别为14、35、60d。无机载体 的吸附容量较低、而且酶容易脱落。 (2)离子交换吸附法: 这是将酶与含有离予交换基的水不溶载 体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢，在工业上 颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨 基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）纤维素、四 乙氨基乙基(TEAE)纤维素、DEAE葡聚糖凝胶、Amberlite IRA93、410、900等。阳离子交换剂 基，如羧甲基(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC50、IR200、Dowex50等。 DEAE-Sephadex固定化氨基

8、酰化酶：将DEAE-SephadexA25充 分溶胀用05mol/LNa0H和水洗涤后，加入pH7.07.5的米 曲霉3042粗酶液(水解乙酰DL-Ala活力为25umol/m1h)充分 混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去 上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶， 置4备用。固定化酶活力回收50-60，水解乙酰DLA1a 活力为600-800umol/gh湿固定化酶。氨基酰化酶也可固定于 DEAE纤维素。 此外，DEAE纤维素吸附的淀粉酶、 蔗糖酶已作为商品固定化酶。 通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷能 有效的克服吸附法制备的固定化酶

9、在使用过程的解吸。 用水溶性乙烯顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白 酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE纤维素和DEAE Scphadex载体有效的固定。这种固定几乎是不可逆的吸 附。此外酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、 温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关。pH的变化影 响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等 电点两侧(1-2pH单位)吸附将明显减少，但也有个别例 外。盐对吸附的影响较为复杂在一些特殊事例中、盐 可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。对蛋 白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。载体的表面积 、多孔性及其顶处理都影响对酶的吸附。 吸附法制备固定化酶操作简单，可

10、充分选择不同电 荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定 化酶在使用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回 收再利用。但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸 附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大，同时 由于吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶 的操作为稳定性。 1.2.2 包埋法 包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进 剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达 到固定化。包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到 化学反应，可以制得较高活力的固定化酶对大多数酶、粗 酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。但是，只有小分 子底物和产物可以通过凝胶网

11、络，而对大分子底物不适宜。 同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为 的变化、活力降低。包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。 (1)凝胶包埋法 凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子中。 聚丙烯酰胺凝胶包埋法。一般的制备过程如下：将1ml溶 于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和 40mgN，N甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中，再加 0.5ml 15的二甲氨基丙腈(加速剂)，同时，加入1过硫 酸钾(引发剂)，混合，于25T：保温10min，便得含酶凝胶 。将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒于低温储存或冷冻干燥 。为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入 到疏水相

12、(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有机溶液中， 使分散成含酶的珠状凝胶。 聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量 蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克 服。 辐射包埋法。酶溶于纯单体水溶液、单体加合物水溶液或 纯聚合物溶液中在常温或低温下，用x射线、Y射线或 电子束辐照。可得到包埋酶的亲水凝胶。如用X射线引发聚 丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。1973年HMaeda等用 聚乙烯水溶液辐照包埋了多种酶。运用弱水性或稍微疏水性 的玻璃化载体，用低温过冷态的辐照聚和，可用于般生物 物质的固定化。这些生物物质主要分布在载体表面层区域， 固定化产物表面具有生物活性，曾称这种方法为粘

13、附法。这 种方法可粘附酶、叶绿素、病毒等，长期使用后仍有较高的 活性。可以使用玻璃化单体，玻璃化单体和非玻璃化单体混 合物、单体和天然聚合物的混合物为载体。 其他凝胶包埋法。 a.淀粉凝胶包埋法。将氨基甲酸乙酯的泡沫垫浸入温热 的淀粉溶液和乙酰胆碱脂酶的混合物中，再经冷却、干燥 ，便制得固定化乙酰胆碱脂酶。，为增强机械强度和重新 水合可加入定量的甘油。 b.b.胶原包埋法即大分子络合法胶原包埋法即大分子络合法。胶原有纤维性，易成膜， 能在生理pH下自发的聚焦成束，胶束末端可以通过多种 次级键与酶分子相互作用，通过酶和胶原分子形成网架而 将酶固定化。其制备方法极为简单：将酶加到胶原悬浮液 中、铺

14、膜、干燥即得固定化酶。或者经过透析的酶和胶原 混合，插入电极，酶胶原复合物便在电极上沉淀。 c.卡拉胶包埋法：卡拉胶(KCarrageenin)是由角叉菜(又名 鹿角菜:Cawageen)中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。具 体方法：将100gx酶在3750溶于水中，又将1.7g卡拉胶在 40一60溶于34ml生理盐水中，二者混合后冷全10，所成凝 胶浸在0.3mol/L KCl 溶液中硬化，作成适当大小的颗粒,即为 固定化酶。 d.天然血纤维包埋法：血纤维不会引起抗体形成，且无毒。 在柠檬酸缓冲液中使酶和血纤蛋白原及凝血酶混合、便制得 血纤蛋白包埋的固定化酶。酶分子的氨基和血纤蛋白的 谷氨酰

15、胺残基之间发生交联而将酶固定化。 e.大豆蛋白包埋法。含葡萄糖异构酶的链霉菌菌株与大豆蛋白 溶液混合，在60用碳酸镁处理使其凝结，过滤制球，干 燥后用戊二醛和六甲叉二胺处理，硬化从而制得固定化葡 萄糖异构酶。 (2)微囊化法 此法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊 内。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落， 防止微囊外环境直接接触从而增加了酶的稳定性同时，小 分子底物能通过膜与酶作用，产物经扩散而输出。微囊一般直 径约1100um，膜厚约100nm，膜上孔径约3.6nm，表面积 与体积之比极大，物质能很快达到平衡，能有效的包埋许多种 酶。同时、可用不同类型、不同浓度的酶、细胞提取

16、物或细胞 ，不同组成和含量的膜包裹组建成人工细胞. 因此，此法在医 疗上极为有用。例如固定化天门冬酰胺酶(治疗白血病)就是用 这种方法制成的微胶囊。微胶囊的制备方法有4种。 界面沉淀法。是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上 溶解度极低而形成膜， 从而将酶包埋的方法。如，含有高浓度血红蛋白的酶溶液在 与水不互溶、沸点比水低的有机相中乳化，加入油溶性表面 活性剂，形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物在 搅拌下加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶 剂使高聚物在油一水界面上沉淀形成膜，最后移于水相， 从而制成固定化酶。作为高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和 聚甲基丙烯酸甲酯等。如“人造细胞”制备：25ml 10%血红 蛋白水溶液(内含适当酶、 界面聚合法。界面聚合法是将疏水性和亲水性单体在界面进 行聚合，形成半透膜,使酶包埋于半透膜微囊中。此法曾用来制 备Asn酶、脲酶等。制备方法一般是：将酶水溶液与亲水单体(如 乙二醇)用一种水不溶混