《椎间盘器官整体培养条件下髓核组织的变化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《椎间盘器官整体培养条件下髓核组织的变化（72页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浙江大学医学院博士学位论文椎间盘器官整体培养条件下髓核组织的变化姓名：李钢申请学位级别：博士专业：外科学（骨外）指导教师：范顺武20100401浙江大学博士学位论文摘要椎间盘器官整体培养条件下髓核组织的变化浙江大学医学院博士研究生导师外科学(骨外)李钢范顺武教授中文摘要椎间盘退变是慢性下腰痛及脊柱功能损害的重要原因【l】。由椎间盘退变可引起如椎间盘突出症、椎管狭窄症、脊柱滑脱症等一系列严重的临床疾患，90以上的脊柱手术与椎间盘退变有关【2】。椎间盘退变的病因学十分复杂，危险因素颇多，我们对它的研究也在逐步的深入。有许多实验方法和实验模型被应用于研究椎间盘的功能，这些实验模型包括在体动物模型及细
2、胞离体培养模型等。在动物模型中，椎间盘退变通常由力学【3罐】或化学【9，10】方法诱导，但它不利于探究与细胞及基质代谢有关的疾病和信号传导方面的问题；许多研究者利用体外细胞培养进行研究【H-a，但失去细胞基质的细胞会发生分化或丧失功能，达不到研究的目的。如果能建立一种椎间盘器官整体培养的方法，就可以确保髓核细胞及其周围基质环境的完整，使细胞与细胞间、基质内部及细胞与基质间的相互作用成为可能，有利于细胞表型及功能的表达，还为研究基质间信号的传导和椎间盘对外界刺激的反应创造了一个实验平台，在椎间盘退变研究方面有一定优势，所以有必要椎间盘器官整体培养方法作相关探讨。浙江大学博士学位论文摘要第一章体外
3、培养椎间盘器官目的：对大鼠椎间盘包括上下软骨终板、纤维环及髓核组织进行整体培养，观察髓核组织的变化，探索椎问盘器官整体培养的实用技术。方法：1、取健康清洁级SD大鼠60只，5-6周龄，1509左右，无菌条件下完整取出腰段椎间盘器官(包括髓核组织、纤维环、上下软骨终板及少量附着于终板的松质骨)共350个，随机分为5组；2、无菌条件下高渗肝素盐水冲洗椎间盘3次，25倍放大镜下进一步修整后置入12孔培养皿内，37。C、5C02条件下培养，高渗DMEMF12培养液通过每1000mI等渗培养液内加入372克NaCL获得，小牛血清浓度：20，每天换液一次；3、任选10个椎间盘器官，随机分为两组，对照组5个
4、椎间盘在培养前置入液氮内浸泡3次，每次浸泡1分钟左右，随后在两组椎间盘的培养液内均加入浓度为10mgml的NBT液240ul，吹打混匀，培养8小时后取出两组椎间盘，高渗盐水冲洗3次，10福尔马林固定48小时，石蜡包埋，切片观察；4、任取75个椎间盘，随机分成5组，每组15个椎间盘，分别在培养的第0、3、7、14、21天取出1组椎间盘，高渗盐水冲洗3次，10福尔马林固定48小时，石蜡包埋，切片观察；取出椎间盘前8小时在培养液内均加入浓度为10mgml的NBT液240“l，吹打混匀；5、任取10个椎间盘，随机分为5组，每组2个椎间盘，分别在在培养的第0、3、7、14、21天取出1组椎间盘，高渗盐水
5、冲洗3次，10福尔马林固定48小时，石蜡包埋，切片，厚度4-6“m，免疫组织化学染色观察；III浙江大学博士学位论文摘要6、任取75个椎间盘，随机分成5组，每组15个椎间盘，分别在培养的第0、3、7、14、2l天取出1组椎间盘，高渗盐水冲洗3次，10福尔马林固定48小时，石蜡包埋，切片，厚度4-6um，HE染色观察；7、任取75个椎间盘，随机分成5组，每组15个椎间盘，分别在培养的第0、3、7、14、21天取出1组椎间盘，高渗盐水冲洗3次，10福尔马林固定48小时，石蜡包埋，切片，厚度4-6“m，番红O染色观察；8、任取100个椎间盘，随机分成4组，每组25个椎间盘，分别在培养的第0、3、7、
6、14天取出1组椎间盘，高渗盐水冲洗3次，无菌条件下剖开椎间盘，每5个椎间盘取出l组髓核组织，每组重量约250“g，Trizol试剂裂解细胞，PCR测试基质蛋白表达。结果：l、可通过解剖获得完整无损的SD大鼠椎问盘器官，但软骨终板表面残留少量松质骨组织；2，NBT可对存活椎间盘细胞着色，而对死亡椎间盘细胞不着色；3、椎间盘器官体外培养两周内，髓核细胞成活率与对照组培养0天细胞成活率比较无统计学意义(P005)，培养21d时成活率显著低于其余各时间点(P005)，培养21天组与其他各时间点灰度值比较均有统计学意义(P年r月f日导师签名签字日期：、。|嶂，歹旯fB浙江大学博士学位论文致谢致谢衷心感谢
7、尊敬的导师范顺武教授四年来的辛勤培养、关心爱护和精心指导，导师的淳淳教诲将使我终身受益，导师严谨的治学态度，精益求精、锲而不舍的工作作风和敏捷的科研思维，将是我今后追随的榜样、终身学-j的偶像。饮水思源，师恩难忘，内心感激之情难以言表。向浙江大学邵逸夫医院赵凤东老师热情帮助和指导致谢。难忘06级同学郭庆渠博士、辛龙博士的帮助。衷心感谢山西医科大学第一医院骨科刘强院长、韩树峰主任在读博期间给予的鼎力支持。感谢师弟张聪明硕士的辛勤劳动。谢谢我的父母、妻子和女儿几年来在生活、学-j上对我的理解、关心和支持。最后衷心感谢各位评委老师在百忙之中来参加我的论文答辩和指导。塑坚查兰堕主兰竺丝奎缩略语一一一一
8、：=：=缩略语(Abbreviation)bpBasepairseDNAComplementaryDNAdCKDeoxycytidinekinaseDAPIdihydrochlorideDMSODimethylsulfoxidedNTPDeoxyribonucleosidetriphosphateDTTDithiothureitolNBTNitrobluetetrazoliumEBEhidiumbromideEDTAEthylenediaminetetraaceticacidEGTAEthyleneglycolbis(2-aminoethylether)tetraaceticacidFBSFe
9、talbovineseumGAPDHhENTlHRPmRNANP40Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenaseHumanequilibrativenucleosidetransporter1HorseradishperoxidaseMessengerribonucleicacidNonidetP40X碱基对互补脱氧核糖核酸脱氧胞苷激酶荧光蓝二甲基亚砜脱氧核苷三磷酸二硫苏糖醇四氮唑盐溴化乙锭二胺四乙酸二钠乙二醇双(2氨基乙基醚)四乙酸胎牛血清磷酸甘油醛脱氢酶平衡型核苷转运蛋白1辣根过氧化物酶信使核糖核酸乙基苯基聚乙二醇浙江大学博士学位论文第一章体外培养椎间盘器官
10、椎间盘器官整体培养条件下髓核组织的变化浙江大学医学院博士研究生导师外科学(骨外)李钢范顺武教授第一章体外培养椎问盘器官11前言椎间盘退变是慢性下腰痛及脊柱功能损害的重要原因，它的病因学十分复杂，危险因素颇多，我们对它的研究也在逐步的深入。有许多实验方法和实验模型被应用于研究椎间盘的功能，这些实验模型包括在体动物模型及细胞离体培养模型等。在动物模型中，椎间盘退变通常由力学或化学方法诱导，但它不利于探究与细胞及基质代谢有关的疾病和信号传导方面的问题；许多研究者利用体外细胞培养进行研究，但失去细胞基质的细胞会发生分化或丧失功能，达不到研究的目的。因此建立一种椎间盘整体的培养方法刻不容缓。12材料与方
11、法121实验动物健康清洁级SD大鼠，56周龄，雌雄不限，1509左右，由大学实验动物中心提供122主要试剂小牛血清NBTGibco公司上海生工生物工程公司浙江大学博士学位论文第一章体外培养椎间盘器官DAPIII型胶原单克隆抗体sp免疫组化试剂盒Trizol引物无水乙醇氯仿(三氯甲烷)异丙醇溴化乙锭Emodin吉西他滨(健择，Gemzar)中性树胶甲醛碘丙啶(PI)甘油溴酚兰柠檬酸钠(sodiumcitrate)盐酸KClNa2HP0412H20KH2P04NaCl脱氧胆酸钠山羊血清甲醇甘氨酸氢氧化钠上海生工生物工程公司北京博奥森生物技术有限公司北京博奥森生物技术有限公司美国Invitrogen
12、公司美国Invitrogen公司杭州长征化工厂国药集团化学试剂有限公司杭州长征化工厂上海生工生物工程公司美国Sigma公司美国Lilly公司北京中山公司杭州长征化工厂上海生工生物工程公司上海生工生物工程公司上海生工生物工程公司上海生工生物工程公司上海生工生物工程公司杭州化学试剂厂杭州化学试剂厂杭州化学试剂厂杭州化学试剂厂上海生工生物工程公司北京中山生物技术公司杭州高晶精细化工有限公司上海生工生物工程公司上海生工生物工程公司浙江大学博士学位论文第一章体外培养椎间盘器官123主要仪器BB5060型二氧化碳培养箱HEALFORCE超净工作台DK一8A电热恒温水浴箱Olympus荧光显微镜DHG一91
13、40A型电热恒温鼓风式干燥箱SHINVA台式灭菌器荧光显微镜HZ一8801K台式恒温振荡器一86低温冰箱一20C冰箱4C冰箱METTLERPM200电子天平微量移液器BIOTekELx800全自动酶标仪LEICA2135切片机YS100光学显微镜PCR仪微波炉电泳仪电泳槽惠普8453紫外分光光度计HS一3垂直混合器ZD9556水平摇床德国HERAEUS公司上海力新公司上海精宏实验设备公司SANYOElectricBiomedicalCo，Ltd上海精宏实验设备公司山东新华医用公司德国Zeiss公司太仓市科教器械厂美国Thermoelectron公司日本SANYO公司山东海尔公司上海电子天平厂法
14、国Gilson公司美国伯乐Biorad公司德国LEICA公司日本NIKON公司美国BioRad公司广东Galanz公司北京六一仪器厂美国Biorad公司美国HewlettPackard公司宁波新芝生物科技有限公司太仓市科教器材厂浙江大学博士学位论文第一章体外培养椎问盘器官124试剂配制1241PBS缓冲液NaCI809KCl029Na2HP0412H203589KH2P04O2789超纯水1000ml，溶解后，调PH至74，121，高压消毒30分钟。1242高渗肝素盐水NaCI1509肝素1250IU09氯化钠液500ml调PH至74，121，高压消30分钟。125主要操作步骤1251切取椎间
15、盘器官步骤1、56周龄sD大鼠一只，1509左右，10水合氯醛以2mlkg腹腔注射麻醉，0005新洁尔灭水浴消毒；2、铺无菌巾，取大鼠背部纵切口，自尾部完整取出腰段及下位胸段脊柱，入高渗肝素盐水冲洗；3、25倍放大镜下钝锐结合切除脊柱后部结构及软组织，自软骨终板与骨性终板结合处锐性分离，得到完整椎间盘器官，少量松质骨与软骨终板结合紧密，不能强行分离，避免损伤软骨终板。1252免疫组织化学(1)取材、脱水、浸蜡、包埋；(2)载玻片防脱片的制备，切片；(3)烤J牛5860。C，3060分钟；(4)二甲苯脱蜡35分钟；4浙江大学博士学位论文第一章体外培养椎间盘器官(5)无水乙醇洗二甲苯2X2分钟；(
16、6)95、80、70酒精各1分钟；(7)PBS清洗3X5分钟：(8)3H20210分钟灭活内源性过氧化物酶，PBS清洗3X5分钟；(9)抗原修复(柠檬酸抗原修复液高压加热修复)95C，10分钟；(10)PBS清洗3X5分钟；(11)正常山羊血清封闭液封闭30分钟，滴加准备好的一抗，100ul，湿盒内4孵育过夜；(EJPBS代替一抗作为阴性对照)；(12)PBS清洗35分钟：(13)二抗，100ul，湿盒内室温l2h，PBS清洗35分钟；(14)DAB显色；(15)苏木素复染；(16)70、80、95、100、100酒精，各1分钟：(17)二甲苯32分钟，中性树胶封片。1253liE染色常规脱水、石蜡包埋，行连续切片，厚约4“m，60。C烤箱融蜡30分钟；二甲苯脱蜡5分钟X2次，1
