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1、微生物实验报告 霉菌的培养及观察实验刘欣怡201100140057 生物科学基地班 组别：周一下午三组 同组者：曹平平，周楠，刘艺，刘希伟 实验完成时间：2012年11月12号一、实验原理1. 观察霉菌的菌落特征，学会霉菌的一般制作方法。2. 观察并理解多种霉菌的个体形态及生长繁殖方式。3. 进一步巩固无菌操作以及显微镜的使用二、实验器材1. 菌种：黑曲霉，毛霉，青霉，根霉的培养 7d 的马铃薯琼脂平板培养物（小室培养）。2. 仪器：无菌操作台，分析天平，玻璃棒，三角瓶，小烧杯，加热炉，漏斗，纱布，培养皿，载玻片，盖玻片，U 型玻璃棒，解剖刀，镊子，接种环，移液管，酒精灯，火柴，显微镜等。3.
2、 试剂及培养基：马铃薯培养基（其配方见附录），蔗糖，琼脂，去离子水100，现配的20%甘油，酒精溶液等。三、实验原理及方法1、霉菌霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放线菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝生长到一定阶段又可分化出繁殖菌丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。 霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约为3-10m）,常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液，用此染液做霉菌制片的特点
3、是细胞不变形，具有杀菌、防腐作用，不易干燥，能保持较长时间，能防止孢子四处飞散，棉兰具有一定的染色作用，染液的蓝色能增大反差。（如果用水封片，常因渗透作用而膨胀，水也易使菌丝、孢子和气泡混为一团，影响观察。）霉菌菌落特征：A。因霉菌的菌丝较粗且长，故形成的菌落较疏松，常成绒毛状、絮状、蜘蛛网状或毡毯状，一般比细菌和放线菌菌落大几倍到几十倍。B。在固体培养基上菌落最初往往是浅色或白色，当菌落上长出各种颜色的孢子后，由于孢子具有不同形状、构造和颜色，使菌落表面呈现肉眼可见的不同结构和色泽，如黄、绿、青、黑、橙等。C。有些霉菌的菌丝还能分泌一些水溶性色素扩散到培养基内，使培养基正面和反面呈现不同的颜
4、色。D。同一霉菌在不同成分的培养基上可形成不同特征的菌落，但各种霉菌在固定的培养基上形成的菌落，其形状、大小、颜色等特征是稳定的，因此菌落特征是鉴定霉菌的重要依据之一。2、观察方法观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本次实验采用载玻片培养观察法（小室培养法）。3、载玻片培养观察法（小室培养法）用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置于显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物。4、有隔菌丝和
5、无隔菌丝： 5、关于本实验所用霉菌的初步认识及比较：四、实验内容 根据本实验提供的四种霉菌，即根霉、毛霉、黑曲霉和青霉，运用小室培养的方法在28下正置培养这四种霉菌，一个培养皿中有两个琼脂小块，分别接种两种霉菌，一周后用显微镜观察这四种霉菌各自的形态特征，记录观察的结果并比较不同霉菌间形态特征上的区别五、实验步骤1、配制马铃薯培养基配制100ml马铃薯培养基（PDA），其成分配比及配制方法见附录。将土豆去皮后切成小块，称取所需量的土豆块后将其放入盛有去离子水的小烧杯中，加热煮沸20分钟，期间可用玻璃棒进行搅拌。加热结束后，添加去离子水使烧杯中溶液为100ml。先用一层纱布（放置在另一个干净烧杯
6、口）进行过滤，然后在用6层纱布过滤上一步中的滤液。最后，向其中加入称量好的糖和琼脂，把液体转移到锥形瓶中，加棉塞并用牛皮纸封口，然后放入灭菌锅中进行灭菌。2、需要灭菌的其他器材 取6个干净的平皿，其中4套平皿中各放入一张滤纸片、一个U型玻璃棒，一个载玻片和4个盖玻片。将这6套平皿包在一起；选取两个2ml的滴管，分别用牛皮纸包好。3、制作琼脂块灭菌后，在酒精灯旁无菌操作倒培养基少量于灭菌培养皿（其底部已经画好了格子）中，静置冷却凝固成薄层。将已在酒精中浸泡一段时间的解剖刀取出，在酒精灯上进行灼烧。解剖刀稍稍冷却后，解剖刀沿着平皿底部已经划好的线切割该培养基，得到为若干1cm左右的琼脂块。4、无菌
7、操作台的准备工作 打开无菌操作台的电源，打开通风开关和紫外线灯开关，关上两侧的玻璃门紫外线照射20分钟。实验操作开始前，关上紫外线灯并打开日光灯。稍打开玻璃门，能放入手的开口距离即可，放入酒精灯并点燃。实验操作过程中，一直通无菌风。5、制作小室在平皿底部铺一张略小于皿底的圆滤纸片，在其上放一U型玻棒。在玻棒上放上一块载玻片。取方形琼脂块，将其移至载玻片上，载玻片两端各放置一块。小室培养的平皿如下图所示(图片是从课本照下来的)。6、接种在酒精灯上方进行无菌操作，将接种环灼烧两次后稍冷却，挑取很少量的菌落接种于琼脂块的边缘上，然后用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。一个培养皿中的U型玻璃棒上有一个载
8、玻片，其上两边各放一个琼脂块，两个琼脂块都需要接种，而且接不同的霉菌,琼脂块上接种了霉菌后，要左右做好标记，以防弄混了各个琼脂块上的霉菌。7、培养两个琼脂块均接种后，用无菌镊子夹取平皿中的盖玻片盖在琼脂块上。然后，继续无菌操作去灭菌的2ml滴管在每个培养小室中的滤纸片上各滴加2ml的20%灭菌甘油,然后盖上皿盖,于27正置培养。8、镜检观察一周后，从培养箱中取出培养皿。直接取出载玻片放在显微镜上进行观察。先在低倍镜后高倍镜进行下观察并记录四种霉菌菌丝体及孢子的形态特征，必要时可换油镜观察。9、实验完成 实验结束后，仪器归位并整理实验台。六、实验结果1、实验记录照片黑曲霉观察视野（图中黑色球状边
9、缘不规则）青霉观察视野图（图中可以看到帚状孢子梗）根霉在油镜下的观察视野（图中可以清晰地观察到囊轴和孢子囊） 毛霉观察视野（图中可清晰地看到完整的孢子囊和破裂的孢子囊）2、实验结果记录及对比表 表I.四种霉菌的观察结果记录表菌种根霉毛霉黑曲霉青霉有无假根有假根、匍匐菌丝无无假根，有足细胞无菌丝形态透明无隔较细无隔透明有隔透明有隔孢子梗形态直立着生于假根上，顶端膨大为孢子囊由菌丝生出，顶端为球形孢子囊由气生菌丝分化，顶端为球状顶囊，孢子梗是辐射状排列,呈冠状分生孢子梗顶端不膨大，无顶囊，多次分生形成小梗，形如扫帚孢子特征孢子囊位于囊轴上，孢子位于孢子囊中，孢子囊呈圆形，表面光滑位于球形黑色孢子囊
10、中，分生孢子黑色不透明，表面粗糙小梗顶端有分节椭圆状孢子图片3、相关资料图片（与自己的进行比较、分析） 青霉 曲霉 根霉 毛霉七、实验结果分析1、获得本实验成功的关键： 在载玻片培养观察中，注意无菌操作，接种量要少并尽可能将分散的孢子接种在琼脂块边缘，避免培养后菌丝过于密集影响观察。2、区分毛霉和黑曲霉： 一般情况下，毛霉的孢子囊的表面光滑，其孢子都在孢子囊内，而黑曲霉的分生孢子梗膨大成球形，其表面有分生小梗，小梗顶端为一串串孢子。所以黑曲霉的球形部位是粗糙面，而且是不规则的球形。但是如果毛霉的孢子囊破裂，其中的孢子释放出来，则容易将该种毛霉和黑曲霉弄混。此时，要注意观察，因为黑曲霉分生孢子梗
11、膨大的球形表面上的分生小梗长短不一，所以圆形边缘不规则，而且因为孢子是黑色所以不易看到其一个个的孢子，但是破裂的毛霉孢子囊处是孢子散落出一片，近乎无圆形可言，但是毛霉孢子近乎无色，相对容易看到其一个个的孢子（40倍物镜下可以清晰地看到一个个的孢子）。 毛霉菌丝无隔，黑曲霉菌丝有隔。 黑曲霉有足细胞，而毛霉没有。3、由根霉的观察图可以看出： 根霉的营养菌丝体透明而且无隔，菌丝体交错勾连在一起，呈树根状；气生菌丝发达；营养菌丝体上产生匍匐枝，匍匐枝的节间形成特有的假根，要找到两个假根才能找到匍匐枝；与假根相对处向上直立着生孢囊梗，其顶端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子；孢子囊表面光滑，其底部右半球型的
12、囊轴。在本小组的实验结果中，能较好的观察到根霉孢子囊部分的结构，而且很清楚。对于假根和匍匐枝这两个本来就不容易观察到的结构，在本班内观察到了 补充：根霉除了无性生殖外，还能进行有性生殖，即结合孢子，大致如下图所示。但是不容易观察到。该图中两个菌丝间共同形成的孢子即结合孢子。（真正的菌丝是弯曲不规则的。）八、实验注意事项1、在使用无菌操作台前，要先打开通无菌风的开关，并打开紫外线灯照射20分钟，这样前期灭菌才彻底2、打开紫外线灯后，一定要把两边的玻璃门合上，这样紫外线就不会泄漏出来。紫外线灯照射无菌操作台20分钟后，一定要关上再进行实验操作，否则会使眼睛受伤。3、使用无菌操作台进行制作小室培养的
13、培养皿时，注意要严格无菌操作，玻璃门开口要小，把手放入即可。4、本实验中虽然在无菌操作台上进行制培养皿操作，但还是要在酒精灯上方进行，双重保险。5、用马铃薯配培养基时，最好把马铃薯去皮后切成小块，这样放入去离子水中进行加热煮沸时马铃薯中的淀粉更容易溶解。6、加热煮沸操作中，一开始可以先多加些水，因为要煮沸20分钟，期间会大量蒸发失水，而且，溶液不足100ml要添加去离子水。7、灭菌时盖玻片不要堆积在一起，而且载玻片、盖玻片不要和平皿接触，防止和平皿粘在一起而不好用镊子夹取。8、倒薄片时，培养基倒入培养皿中的量要少，制作成很薄的平板。9、倒平板可以不用再无菌操作台上进行。10、接种时尽可能将菌种
14、接在琼脂块边缘，避免培养后菌丝过于密集影响观察。11、接种时确认有菌接上即可，接菌量不宜过多，会导致菌丝过密难以观察12、注意，培养皿底部必需要加甘油，作用是保持培养皿内的湿度。13、注意，培养皿底部放一小片圆形滤纸片，目的是防止加入的甘油随处流动而沾湿培养基中其他处。14、注意，本次实验的培养皿要正置培养，千万不要倒过来。15、解剖刀一定要先在酒精中浸泡，然后使用前在酒精灯上灼烧，保证灭菌彻底，以防在切割培养基时引入细菌。16、解剖刀在灼烧后要稍稍冷却，否则过热的刀片接触到培养基会使接触处的培养基稍融化，不利于切割。17、可以先在培养皿底部打上格子，边长1cm的正方形，然后再倒入培养基，静置冷去后沿线用解剖刀划开即可。18、用灭菌的解剖刀挑起小块培养基，放在载玻片两端。19、在向小块培养基上盖盖玻片时要注意不要产生气泡，以免影响以后观察。20、可以直接从培养皿中取出载玻片。放到显微镜上观察。21、用10倍到40倍的物镜进行观察即可，根据视野进行调整。22、实验结束后，仪器归位，整理实验台。九、实验思考题1、黑曲霉和黑根霉在形态特征上有何区别？答：菌丝：根霉无隔有假根，曲霉无隔有足
