基因工程操作的基本程序讲解

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1、基因工程操作的基本程序 三、基因工程操作的基本程序 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 1、目的基因的获取 （一）提取目的基因 主要有两条途径： 一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因； 另一条是人工合成基因。 从基因文库中获取 基因组文库 cDNA文库 人工合成 直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法” 。 直接分离基因 鸟枪法的具体做法是： 用不同的限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段， 将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别 转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA(外 源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制 (在遗传学中叫做扩

2、增)，从中找出含有目的基因的 细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段 分离出来。 从基因文库中获取 1、基因文库： 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入 受体菌的群体储存，各个受体菌分别含有这种生 物的不同的基因。 2、基因组文库： 含有一种生物所有基因的菌体。 限制酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 是指将某种生物体的全部DNA用 适当的限制酶切割成一定长度范围 的DNA片段，再与合适的载体在体外 重组后，导入受体菌的群体中储存 ，这个群体就称为该生物基因组文 库。其目的是分离有用的目的基因 和保存某种生物的全部基因。 从基因文库中获取 3、部分基因文库（如cDN

3、A文库）： 含有一种生物部分基因菌体。可由mRNA反转录 而来。 如：cDNA( 互补DNA)： 是由生物的某一特定器官或 特定发育时期细胞内的mRNA 经体外反转录后形成的互补 DNA片段，与载体连接后储 存在一个受体菌群中，这个 受体菌群就叫做这种生物的 cDNA文库 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 从基因文库中获取 3、部分基因文库（如cDNA文库）： 含有一种生物部分基因菌体。可由mRNA反转录 而来。 4、构建基因文库的目的： 为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得 所需的目的基因。 5、 cDNA文库如何构建？ 如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录 产生的多种互

4、补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接 后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体 就构成了这种生物的cDNA文库。这种方法称反 转录法 cDNA文库的构建 mRNA 反转录 cDNA (互补DNA） DNA聚合酶 双链DNA 反转录法： 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 6、基因组DNA文库的构建 用不同的限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段， 将这些片段分别载入载体，然后通过载体分别转入 同一菌体不同的受体细胞，让供体细胞所提供的 DNA(外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中 大量复制。 基因组DNA文库 cDNA文库 7、基因组DNA文库与cDNA文库的比较 基因组DN

5、A文库与cDNA文库的比较 文库类型cDNA文库基因组文库 文库大小小大 基因中启动子无有 基因中内含子无有 基因多少某种生物的部分 基因 某种生物的全部 基因 物种之间的 基因交流 可以部分基因可以 说明 基因文库的组建过程就包含基因工程 的基本操作步骤。从基因文库中获取 目的基因的优点是操作简便,缺点是工 作量大,具有一定的盲目性 人工合成基因 在获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成 基因的方法。目前人工合成基因的方法主要有两条途 径： 1.是反转录法。 2.是根据已知的蛋白质的氨基酸序列合成DNA（基因） . （1）、反转录法 以目的基因转录成的 为模板， 在 作用下，反转录成互

6、补的 单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA， 从而获得所需要的基因。 反转录法的优点是针对性强。缺点是操作复杂，信使 RNA稳定性差，生存时间短。 信使RNA 反转录酶 （2）根据已知的蛋白质的氨基酸序列合成DNA（基因） 根据已知的蛋白质的 ，推测出相应的 信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它 的结构基因的核苷酸序列，再通过化学的方法， 以单核苷酸为原料合成目的基因。 氨基酸序列 1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的 A、染色体DNA B、线粒体DNA C、总mRNA D、tRNA 2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库 的描述正确的是 A、某生物的全套

7、基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生 物 体内，则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库 A C 利用PCR扩增目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 PCR： 是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成 技术。 原理：DNA复制 原料： 模板DNA；RNA引物；脱氧核苷酸（ATP、CTP、 TTPGTP）；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子 方法： DNA受热变性解旋为单链、冷却后引物与单链相 应互补序列结合、DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。 特点： 指数形式扩增

8、 加热（9095） 降温（5560） n 过程变性、退火、延伸三步曲 变性：加热至9095 双链DNA解链成为单链 DNA 退火：冷却至5560 部分引物与模板的单链 DNA的特定互补部位相配 对和结合 延伸：加热至7075 以目的基因为模板，合 成互补的新DNA链 变性 退火 延伸 PCR(多聚酶链式反应) 1、DNA（或目的基因 ）经加热至9095后，使DNA双链 或目的基因的双链DNA解离，使之成为单链，以便它 与引物结合，并作为模板。 2、温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序 列配对结合； 3、DNA模板引物在TaqDNA聚合酶的作用下， 以dNTP为反应原料，DNA（或目的

9、基因 ）为模板，按 碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的子链。 过程 重复上述过程，就可获得更多的“子链”，而且新链又可 成为下次的模板。 DNA（或目的基因 ）指数形式扩增 PCR技术DNA复制 相 同 点 原理 原料 条件 不 同 点 解旋 方式 场所 酶 结果 DNA复制(碱基互补配对) 四种游离的脱氧核苷酸 模板、ATP、酶、原料、引物 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制主要在细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 (Taq酶) 细胞内含有的DNA聚合酶 在短时间内形成 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 PCR扩增技术与DNA复制的比较 1、在遗传工程中，

10、若有一个控制有利性状的DNA分 子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR 技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四 种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定 DNA聚合酶引物 温度变化 恒温 A B C D D 2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧 核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩 增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧 核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个 B 1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最 方便方法是 A、化学合

11、成法 B、基因组文库法 C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应 2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩 增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学 方法人工合成 A B C D A D 3、目的基因主要是指_的结构基因。获 得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中获 取目的基因，根据基因的_序列，基因在 _上的位置，基因的_产物mRNA，基因的 _产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用PCR技 术扩增目的基因，该技术是一项在_完成的核酸 合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_ 序列，以便于合成_。（3）如果基因较小且核 苷酸序列已知，可

12、以通过_方法。 编码蛋白质 核苷酸 染色体转录 表达 体外 核苷酸引物 人工合成 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它 是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基 因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的 基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 （二）基因表达载体的构建 2目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在；可以遗传给 下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。 3 .基因表达载体的组成 目的基因 启动子 终止子 标记基因 1地位：是基因工程的核心。 启动子：位于基因的

13、首端的一段特殊的DNA片断，它 是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基 因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的 基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 用同种的限制酶处理目的基因和载体，获得相同的 黏性末端或平末端。 在适量的 作用下，载体的黏性末端 或平末端与目的基因DNA片段的黏性末端就会因碱基 互补配对而ATP（结合，形成了一个重组DNA分子。 DNA连接酶 5、条件： 同种限制酶、DNA连接酶、目的基因、启动子、 终止子、标记基因） 此处有三种连接形式？ 4.过程：将

14、 结合的过程，主要是 不同来源的DNA重新组合(也叫重组质粒)的过程。 目的基因与载体 目的基因与运载体结合（以质粒为运载体） 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点， 图l、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答 下列问题： （1）一个图1所示的质粒分子经Sma 切割前后，分别 含有 个游离的磷酸基团。 （2）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越 多，质粒的热稳定性越 。 （3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用 Sma 切割，原因是 。 （4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防 止 。 （5）

15、为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因 片段混合，并加入 酶。 （6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 。 载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制 原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了 目的基因、启动子、终止子三部分结构 用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到 DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化 学键都是磷酸二酯键 启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体 的方式携带进去。 注意 （三）将目的基因导入受体细胞 1、转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持 稳定和表达的过程。 2、基因工程中常用的受体细胞有： 大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌、酵母菌和动 植物细胞 1、将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌 转化法 特点: 能感染双子叶植物和祼子植物, 对多数单子叶植物无感染能力 Ti质粒的TDNA可转移至受 体细胞并整合到其染色体上 转化过程: Ti是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的 一种染色体外自主复制的环形双链 DNA分子。 Ti质粒 目的基因 构建 表 达 载 体 导入 植 物 细 胞 插入植物细胞 染色DNA 表达 新 性 状 转入 农 杆 菌 ？ ？ ？ ？ ？ （2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，