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1、细胞工程主要技术 2 动物细胞工程动物细胞工程主要主要技术技术 l第一章 动物细胞转化（诱变） l第二章 细胞融合技术 l第三章 哺乳动物克隆技术 l第四章 哺乳动物胚胎培养与移植 l利用杂交瘤制备单克隆抗体技术 l干细胞技术 3 第一章第一章 动动动动物物细细细细胞的胞的转转转转化（化（诱变诱变诱变诱变 ） 通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株，我国业已通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株，我国业已 建立了上百个细胞株，为细胞生物学和医学做出了重大贡献建立了上百个细胞株，为细胞生物学和医学做出了重大贡献 。 正常组织的初级培养物，在传代培养过程中，细胞的寿正常组织的初级培养物，在传代培养
2、过程中，细胞的寿 命有一定的限度，只有命有一定的限度，只有癌细胞癌细胞和和发生转化的细胞发生转化的细胞才能无限增才能无限增 殖下去。殖下去。 所谓所谓转化即是即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变 而成为具有癌特性的细胞。 4 建立无限细胞系的关键建立无限细胞系的关键就是要就是要千方百计千方百计 地使培养细胞发生转化，地使培养细胞发生转化，即用某种因子刺激即用某种因子刺激 正常细胞发生突变而具有癌特性。正常细胞发生突变而具有癌特性。 目前目前，使正常培养细胞发生转化的，使正常培养细胞发生转化的刺激刺激 因子因子主要有主要有三大类三大类：物理因子、化学因子和物理因子、化学因子和 生物因子生物因
3、子。 5 （一）物理因子 能使培养能使培养细细细细胞胞发发发发生生转转转转化的化的物理因子主要是指物理因子主要是指 一些一些电电电电离离辐辐辐辐射：射： 放射性同位素的射放射性同位素的射线线线线：60 60Co Co、14 14C C、 、 131131I I、 、32 32P P、 、 3 3 H H X 射线射线 紫外线照射紫外线照射 物 理 致 癌 剂 6 （二）化学因子 对细对细对细对细 胞具有胞具有转转转转化作用的化作用的化学因子达数千种之化学因子达数千种之 多，其中有无机物，也有有机物。多，其中有无机物，也有有机物。 无机物：砷、石棉、砷、石棉、铬铬铬铬化合物、化合物、镍镍 镍镍化
4、合物、化合物、镉镉镉镉化化 合物合物 有机物：苯、苯、联联联联苯胺、苯胺、杂环烃杂环烃杂环烃杂环烃 、煤焦油、黄曲霉 、煤焦油、黄曲霉 素素(aflatoxin)(aflatoxin)、亚亚亚亚硝胺、烟碱硝胺、烟碱 (nicotine)(nicotine) 化 学 致 癌 剂 7 （三）生物因子 对细对细对细对细 胞具有胞具有转转转转化作用的生物因子化作用的生物因子为为为为肿瘤病肿瘤病 毒毒(tumor (tumor virus)virus)，又称，又称致癌病毒致癌病毒(oncogenic (oncogenic virus)virus)。 现现现现已已发现发现发现发现 有有许许许许多种病毒可引
5、起多种病毒可引起动动动动物或植物物或植物 发发发发生生肿肿肿肿瘤。瘤。肿肿肿肿瘤病毒中有瘤病毒中有DNADNA病毒，也有病毒，也有RNARNA 病毒。病毒。 8 Rous肉瘤病毒(Rous (Rous sarcoma sarcoma virus)virus)：一种一种 RNARNA病毒，其基因病毒，其基因组组组组含有一个含有一个癌基因癌基因srcsrc，编码编码编码编码 产产产产物物为为为为具有具有蛋白蛋白质质质质激激酶酶活性的活性的pp60pp60src src蛋白 蛋白，可使，可使 许许许许多蛋白多蛋白质质质质磷酸化，通磷酸化，通过级联过级联过级联过级联 反反应应应应，诱发细诱发细诱发细诱
6、发细 胞癌胞癌 变变变变。 pp60pp60src src蛋白 蛋白是一种膜蛋白，是一种膜蛋白，结结结结合在合在质质质质膜的内膜的内 表面，它表面，它可催化磷酸根可催化磷酸根转转转转移到一些蛋白移到一些蛋白质质质质的酪氨的酪氨 酸残基酸残基上，使磷酸上，使磷酸化酪氨酸在化酪氨酸在细细细细胞中的含量提高胞中的含量提高 了了1010倍。倍。 9 (Src(Src蛋白蛋白, Tyr, Tyr激酶激酶) ) P P TyrTyr 蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化 细胞癌变 无活性无活性 pp60pp60src src RSV病毒中v-src基因的致癌机制图解 质膜质膜 跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白 细胞外配体细胞
7、外配体 活性活性p pp60p60src src 质膜质膜 跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白 磷酸化酪氨酸两种作用 ： 一是使细胞的正常调节 机制失调,细胞增殖失去 控制； 二是使细胞的粘着性丧 失,易发生扩散和转移。 10 虽然虽然动物细胞动物细胞在培养皿、培养瓶、培养板中均可生在培养皿、培养瓶、培养板中均可生 长，但长，但在体外利用培养罐进行大量培养就不象培养细菌在体外利用培养罐进行大量培养就不象培养细菌 和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题之一。和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题之一。 目前目前这这这这一一问题问题问题问题 已已经经经经解决，人解决，人们们们们在微生物培养用的在微生物培
8、养用的 发发发发酵罐的基酵罐的基础础础础上研制出一种用于上研制出一种用于哺乳动物细胞培养的反哺乳动物细胞培养的反 应罐应罐，用以大量培养用以大量培养悬悬悬悬浮浮细细细细胞（胞（1 1个振个振动搅动搅动搅动搅 拌器：可以拌器：可以 使使细细细细胞得到充足的胞得到充足的营营营营养和氧气）。养和氧气）。 转化动物细胞的规模化培养转化动物细胞的规模化培养 11 细胞融合细胞融合(Cell (Cell fusion)fusion)又称为细胞杂交又称为细胞杂交(Cell (Cell hybridization)hybridization)，现多统称为细胞杂交，现多统称为细胞杂交，是是指指2 2个或个或2
9、2个以个以 上的细胞融合成上的细胞融合成1 1个细胞的过程个细胞的过程。 人工的人工的细细细细胞融合开始于胞融合开始于1950s1950s，此后作，此后作为为为为一一门门门门新新兴兴兴兴技技 术发术发术发术发 展非常快，展非常快，应应应应用范用范围围围围也极也极为为为为广泛，不广泛，不仅仅仅仅同种同种类细类细类细类细 胞胞 间间间间可以融合，种可以融合，种间远缘细间远缘细间远缘细间远缘细 胞也能融合。胞也能融合。 细胞工程的发展是建立在细胞融合基础上的细胞工程的发展是建立在细胞融合基础上的。 第二章第二章 细胞融合技术细胞融合技术 12 细细细细胞融合不胞融合不仅仅仅仅可用于生物学的基可用于生
10、物学的基础础础础理理论论论论研究，研究， 而且在生而且在生产实产实产实产实 践上践上还还还还有重要的有重要的应应应应用价用价值值值值，如目前在如目前在 单单单单克隆抗体的制克隆抗体的制备备备备、核、核质质质质关系、体关系、体细细细细胞的胞的遗传遗传遗传遗传 和和发发发发 育、新品种的培养、免疫作用、疾病的治育、新品种的培养、免疫作用、疾病的治疗疗疗疗和性状和性状 的改良、潜伏病毒的研究等，已取得了的改良、潜伏病毒的研究等，已取得了显显显显著的成著的成绩绩绩绩 。 其中最突出的就是在制其中最突出的就是在制备备备备单克隆抗体单克隆抗体方面的方面的应应应应用！用！ 13 根据所用促融根据所用促融剂剂
11、剂剂的不同，的不同，细细细细胞融合技胞融合技术术术术主要主要 可分可分为为为为四大四大类类类类： 病毒介导的细胞融合技术病毒介导的细胞融合技术 化学介导的细胞融合技术化学介导的细胞融合技术 电击介导的细胞融合技术电击介导的细胞融合技术 激光介导的细胞融合技术激光介导的细胞融合技术 14 一、病毒介导的细胞融合技术一、病毒介导的细胞融合技术 vv促融剂：促融剂：麻疹病毒、副流感病毒、新城鸡麻疹病毒、副流感病毒、新城鸡 瘟病毒、仙台病毒以及其他一些副粘液科瘟病毒、仙台病毒以及其他一些副粘液科 的病毒的病毒 vv基本原理：基本原理：病毒被膜中的糖蛋白含有融合病毒被膜中的糖蛋白含有融合 蛋白蛋白(fu
12、sion (fusion protein)protein), , 既可介导病毒同宿主细既可介导病毒同宿主细 胞融合胞融合, , 又可诱导细胞与细胞融合。又可诱导细胞与细胞融合。 操作繁琐；操作繁琐； 促融效果较好促融效果较好 15 融合蛋白融合蛋白是副粘病毒的两种包膜糖蛋白之一是副粘病毒的两种包膜糖蛋白之一 ，其，其主要功能是引起病毒包膜与靶主要功能是引起病毒包膜与靶细细细细胞膜或被感胞膜或被感 染的靶染的靶细细细细胞膜之胞膜之间发间发间发间发 生融合。生融合。 细细细细胞融合胞融合过过过过程程需要另一种包膜糖蛋白需要另一种包膜糖蛋白 血凝素血凝素- -神神经经经经氨酸氨酸酶酶的的协协协协助。
13、助。融合蛋白需要和同融合蛋白需要和同 源性血凝素源性血凝素- -神神经经经经氨酸氨酸酶酶共同表达才能共同表达才能显显显显示出融示出融 合合细细细细胞的活性。胞的活性。 16 病毒病毒 增殖增殖 紫外线灭活紫外线灭活 稀释稀释 细胞悬液细胞悬液 细胞融合细胞融合 诱导诱导 基本操作流程基本操作流程 筛选筛选 17 二、化学介导的细胞融合技术二、化学介导的细胞融合技术 聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol(polyethylene glycol，PEGPEG ) ) vv促融剂：促融剂： vv基本基本原理：原理：一般认为，一般认为，PEGPEG改变各类细胞的膜结构改变各类细胞的
14、膜结构 ，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发 生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层 的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临 的重排质膜在修复时相互合并在一起的重排质膜在修复时相互合并在一起, , 使两细胞的胞使两细胞的胞 质沟通质沟通, , 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。从而造成相互接触的细胞之间发生融合。 操作简便；操作简便； 促融效果好促融效果好 18 诱导 基本操作流程基本操作流程 A A细胞细胞 融合细胞 B B细胞细胞 A/B
15、A/B细胞混合物细胞混合物 按一定数量比例混合 与细胞混合物充分混匀与细胞混合物充分混匀 一定温度、一定时间一定温度、一定时间 计数 筛选筛选 PEG配制：加热 溶化，按体积比 加入预热至50oC 的无血清培养基 后混匀，降温至 使用温度待用 PEGPEG配制配制 PEG(MW1000-PEG(MW1000- 4000, 4060%)4000, 4060%) 19 促融效果与促融效果与PEGPEG的分子量及其浓度成正比；的分子量及其浓度成正比； 但但PEGPEG分子量越大、浓度越高分子量越大、浓度越高, , 对细胞的毒对细胞的毒 性也就越大（在实验时常常采用的分子量性也就越大（在实验时常常采用
16、的分子量 1000400010004000的的PEGPEG，浓度一般为，浓度一般为4060%4060%） PEGPEG介导细胞融合效果的影响因素：介导细胞融合效果的影响因素： 1. PEG1. PEG分子量与浓度分子量与浓度: : 融合效果与温度成正比（质膜流动性与温度融合效果与温度成正比（质膜流动性与温度 成正比），为获得最佳融合效果成正比），为获得最佳融合效果, , 在细胞可在细胞可 能承受的温度范围内可适当提高处理的温度能承受的温度范围内可适当提高处理的温度 （哺乳动物细胞，一般采用（哺乳动物细胞，一般采用38403840） 2. PEG2. PEG的的pHpH值值: : pH8.08.2pH8.08.2：融合效果较好：融合效果较好 3. PEG3. PEG作用时间作用时间: : 处理时间越长，融合效果越好处理时间越长，融合效果越好, , 但对细胞的但对细胞的 毒害也就越大（一般将处理时间限制在毒害也就越大（一般
