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1、亲子鉴定的基本原理和 方法 荣 媛 whushine 武汉大学中南医院 检验科&法医司法鉴定所 1 亲子鉴定发展概况 不科学 2 亲子鉴定与遗传标记 n亲子鉴定：应用生物学技术方法来检测遗传标 记，并依据遗传学理论进行分析，从而对被检者 之间是否存在生物学亲缘关系所作的科学判定， 实质是一种特殊的个体识别 血液细胞表面的标记 血液蛋白质质的标记标记 蛋白质标记 DNA标记 u 限制性酶切片段多态性 u DNA长度多态性（微卫星STR ） u DNA序列多态性 3 蛋白标记：蛋白标记： 红细胞红细胞ABO,Ph,MN,Kell,Duffy,PABO,Ph,MN,Kell,Duffy,P等等212
2、1个血型系统个血型系统 白细胞白细胞HLA-AHLA-A，-B-B，-C-C，-D-D，-DP-DP，-DQ-DQ，-DR-DR DNADNA标记：标记： RFLPRFLP，VNTRVNTR，STR STR ，SNPSNP 蛋白标记：蛋白标记： 血清型血清型 HpHp， GcGc, Bf, , Bf, TfTf, C2, , C2, 酶型酶型 PGMPGM，EsDEsD，ACPACP，GPTGPT 遗传标记分类 4 蛋白质遗传标记（血型检查 ） n由等位基因决定的红细胞表面抗原的差异，为最 早用于亲子鉴定的遗传标记，有ABO、MN、P、Rh 等21个血型系统。 特点： 遗传性状简单，符合孟德尔
3、遗传规律 遗传多态性，不易受年龄、性别、疾病影响 操作简单、重复性好，结果明确 5 ABO血型检查 人的ABO血型是受A,B,O 三个复等位基因控制的， O为隐性基因，A、B为显 性基因。 决定ABO血型的基因型 AO,AA,BO,BB,OO,AB等 6种，表现型有4种：A型 、B型、 AB型和O型；根 据孟德尔遗传规律，即可 计算出孩子的可能血型的 概率。 6 红细胞ABO血型检查 孩子的血型不是唯一确定的 除了A型血与B型血的人婚配外，其他血型 组合都有概率为0的不可能事件 只能否定 7 蛋白质遗传标记检测的局限性 n对检材需要量大，且对时限要求较高，蛋白质容易失活而 得不到理想的结果，不
4、适用于陈旧、微量检材（HLA分型 要求采血后16-24小时内必须检验） n多态性信息含量有限，鉴别能力有限，只能用于父权排除 ，准确率较低，不宜用于父权肯定和同一认定 n存在有生理或病理性变异（如：A，O型血的人受大肠杆菌 感染后B抗原的检测可能呈阳性） 8 DNA分子遗传标记的检测 vDNA指纹技术（RFLP）：第一代遗传标记 vPCR分型技术：第二、三代遗传标记的检测( 微卫星STR位点和单核苷酸多态性SNP) 线粒体DNA SNP 核内染色体 STR 9 n1985 英国 Jefferys Nature n人源小卫星 DNA 用作基因探针，同人体核 DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位
5、点上 的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹， 这种图纹极少有两个人完全相同，故称为 “DNA指纹“ n实验程序：基因组DNA的提取 限制性内切酶消化酶切 电泳分离 印迹转移 探针制备和标记 分子杂交和自显影 DNA指纹技术（RFLP） 10 DNA指纹技术（RFLP ） n实验结果（DNA指纹图谱）： n优点：群体多态性高，稳定遗传，孟德尔遗传 n缺点：操作繁琐、对检材的质、量要求较高、灵敏度低、 没有种属特异性 11 PCR分型技术（现代DNA亲子鉴定方法 ） PCR扩增序列多态性标记（PCR-SNP分析 ） PCR扩增长度多态性标记（PCR-STR分型 ） 优点：快速、简便、灵敏、特异，适
6、用于 微量陈旧的生物学检材 12 TAGATAGATAGA TAGA TAGA TAGA 1 2 3 4 5 n微卫星DNA，简短串联重复（STR） n是一种广泛分布在人类基因组中具有长度多态性 的DNA序列。由2-6bp的核心序列头尾相连串联 重复构成，通常重复4-60次不等（串珠结构） PCR扩增长度多态性标记 13 n(TTTTA)4 76bp n(TTTTA)4 TTTTA 81bp n(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA 91bp n(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 96bp n(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TT
7、TTA TTTTA 101bp n(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 106bp n(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 111bp Apo(a)基因 14 STR的特点 多态性（Polymorphism ）：主要由核心序列拷 贝数目即重复次数的变化，产生长度多态性 目前国内外最广泛应用的遗传标记 多态性信息含量大，准确率高达99.99999%，可 用于个体识别 扩增片段较短（100-300bp），易于检测，适用 的生物检材类型广泛 灵敏度高，50pg，对于检材要求不高 15
8、16 DNA条带、重复次数与遗传的关系 17 STR等位基因命名 n等位基因通过PCR产物长度来区分和命名 18 样本收集 DNA提取 多重PCR ABI3130 毛细管电泳 结果分析 签发报告 亲子鉴定 （STR检测） 的流程 19 检材的收集 血液 精液 颊粘膜 病理切片 头发 牙齿 骨骼 组织 石蜡包埋组织 血痕 Only a very small amount of blood is needed to obtain a DNA profile 20 样本收集 DNA提取 多重PCR ABI3130 毛细管电泳 结果分析 签发报告 STR检测 的流程 21 ORGANICFTA Pap
9、erCHELEX Blood stain PUNCH WASH Multiple Times with extraction buffer PERFORM PCR PCR Reagents SDS, DTT, EDTA and proteinase K INCUBATE (56 oC) Phenol, chloroform, isoamyl alcohol QUANTITATE DNA Apply blood to paper and allow stain to dry Blood stain VORTEX (NO DNA QUANTITATION TYPICALLY PERFORMED W
10、ITH UNIFORM SAMPLES) Water INCUBATE (ambient) 5% Chelex INCUBATE (100 oC) REMOVE supernatant INCUBATE (56 oC) QUANTITATE DNA PERFORM PCR PERFORM PCR Centrifuge Centrifuge Centrifuge Centrifuge REMOVE supernatant TRANSFER aqueous (upper) phase to new tube CONCENTRATE sample (Centricon/Microcon-100 or
11、 ethanol precipitation) Centrifuge TE buffer Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press DNA的提取 22 样本收集 DNA提取 多重PCR ABI3130 毛细管电泳 结果分析 签发报告 STR检测 的流程 23 多重荧光PCR 24 D3S1358TH01D21S11D18S51Penta E D5S818D13S317D7S820D16S539CSF1PO Penta D AMELVWAD8S1179T
12、POXFGA PowerPlex 16 kit (Promega Corporation) ILS600 CXR size standard CXR (Red) FL (Blue) JOE (Green) TMR (Yellow) PCR product size (bp) Figure 5.4, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press D3S1358TH01D21S11D18S51Penta E D5S818D13S317D7S820D16S539CSF1PO Penta
13、 D AMELVWAD8S1179TPOXFGA PowerPlex 16 kit (Promega Corporation) ILS600 CXR size standard CXR (Red) FL (Blue) JOE (Green) TMR (Yellow) D3S1358TH01D21S11D18S51Penta E D5S818D13S317D7S820D16S539CSF1PO AMELVWAD8S1179TPOXFGA PowerPlex 16 kit (Promega Corporation) ILS600 CXR size standard CXR (Red) FL (Bl
14、ue) JOE (Green) TMR (Yellow) D3S1358TH01D21S11D18S51Penta E AMELVWAD8S1179TPOXFGA PowerPlex 16 kit (Promega Corporation) ILS600 CXR size standard CXR (Red) FL (Blue) JOE (Green) TMR (Yellow) D3S1358TH01D21S11D18S51Penta E AMELVWAD8S1179TPOXFGA PowerPlex 16 kit (Promega Corporation) ILS600 CXR size s
15、tandard CXR (Red) FL (Blue) JOE (Green) TMR (Yellow) AmpFlSTR Identifiler kit (Applied Biosystems) 6-FAM (Blue) VIC (Green) NED (Yellow) PET (Red) D8S1179D21S11D7S820CSF1PO D3S1358TH01D13S317D16S539D2S1338 D19S433D18S51TPOXVWA AMELD5S818FGA GS500 LIZ size standard LIZ (Orange) AmpFlSTR Identifiler kit (Applied Biosystems) 6-FAM (Blue) VIC (Green) NED (Yellow) PET (Red)AMELD5S818FGA GS500 LIZ size standard LIZ (Orange) 25 样本收集 DNA提取 多重PCR ABI3130 毛细管电泳 结果分析 签发报告 STR检测 的流程 26 Laser Inlet Buffer Capillary filled with polymer solution 5-20 kV -+ Outlet Buffe
