流感病毒实验室检测综述

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1、流感病毒实验室检测技术 及盲样考核结果分析 湖南省疾病预防控制中心 微生物检验科 黄一伟 2013-12-27 流感监测目的 （一）监测流感活动水平和流行动态； （二）及时发现流感病毒变异并作出预警 ； （三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测 和推荐提供依据。 流感监测内容 （一）流感样病例监测 （二）流感样病例暴发疫情监测 流感样病例监测标本采集 采集对象： 流感样病例 发热（体温38），伴咳嗽或咽痛之一者 采集时间：病人发病的头3天内采集 采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院 采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家 哨点医院每周至少采集515份流感样病例的 标本(根据流行季节、流行强度

2、、防控工作需要实时 调整） 暴发疫情标本采集 （1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体 单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例 及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留 观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联 的死亡病例； （2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内 出现流感样病例异常增多。 每一起暴发疫情一般应当采集10份左右咽、鼻 拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当 尽量全部采样）。 采集标本类型 常规 特殊 咽拭子 鼻咽/呼吸道吸取物 鼻拭子 鼻洗液 痰液 呼吸道灌洗液 肺组织活检标本 尸检标本 采样液 常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hanks液或 MEM； 标本

3、采集后应立即放入适当的采样液中低 温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL ） 咽拭子采集 咽拭子 用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料 杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉 签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部弃 去，旋紧管盖。 标本的保存与运送 标本采集后应在4条件下，尽快（哨点监 测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网 络实验室 未能送至实验室的，应置-70或以下保存 ，一周内送实验室 冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷 藏条件下送到实验室 实验室生物安全要求 l季节性流感病毒分离鉴定在生物安全级 实验室进行。 l流感病毒分离鉴定及其它

4、检测过程中所有 能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物 安全级实验室的生物安全柜里操作。 l用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生 物安全级实验室进行 标本的接收 接收标本时必须核对送检表 流感监测网络实验室的工作人员接到标本 后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例 标本原始登记送检表”（表2）录入到“监 测信息系统” 标本的处理 标本送至实验室后，立即进行处理，未加 抗菌素的加入适量的抗菌素。 将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于 MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接 种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测 程序实时调整） 实验室检测 核酸检测 病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞培养

5、胶体金快速检测 检测流程 临床标本采集 接种MDCK细胞 接种鸡胚 红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒 红细胞凝集试验 寄送国家流感中心 流感病毒核酸检测阳性 核酸检测 核酸提取- QIAamp Viral RNA Mini Kit 1）在1.5ml 离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。 2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚 尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10 悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。 3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。 4）将Viral RNA Mini spin柱子取出，将步骤3的混合液吸取 630ul

6、加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。 5）重复步骤4。 6）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm离心1min。弃套管及其离心液。 7）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液， 13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。 8）将吸附柱放入一新的1.5ml 离心管中，于柱中加入60ul的 AVE液，室温静置13分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即 为提取的病毒RNA，立即实验或20以下保存。 荧光定量PCR 第一次使用前引物稀释 1引物工作浓度（40M） 配制方法： （1）将新合成的引物开盖前短暂离心（1

7、2000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物 浓度为100M，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若2OD的量 为9.1 nmol ，加水量为109.191l） （3）将100M的引物2.5倍稀释，此时浓度为40M，可作为工作浓度。 2探针工作浓度（10/20M/） 配制方法： （1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物 浓度为100M，可作为储存液。 （3）将100M的探针10/5倍稀释，此时浓度为10

8、/20M，可作为工作浓度。 荧光定量PCR 引物和探针 稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避 光2-8可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）； 涡旋振荡引物和探针； 瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。 real-time RT-PCR的试剂 QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443 注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保 持低温。 荧光定量PCR 反应体系和条件 试剂：Invitrogen SuperScript III Platinum One -Step Quantitative Kit （公司： Invit

9、rogen，货 号：11732-020或11745-100） 分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶 和DNA酶) 正反向引物 (40M) 双重标记探针(10M) 反应条件：逆转录50 30min95 2min （95 15s 55 30s*）45 反应体系为25ul 注：*在55 度这一步骤中要收集荧光信号（ FAM） 荧光PCR结果阳性样品 荧光PCR结果阴性样品 荧光PCR结果可疑样品 病毒分离-MDCK细胞 标本接种标本接种MDCKMDCK细胞细胞 每日观察细胞病变每日观察细胞病变(CPE)(CPE) MDCKMDCK细胞收获细胞收获 3335培养 接种流程 清洗MDCK 细胞 临床采样标本接

10、种细胞 Hanks液清洗细胞，一般清洗2遍 3335度吸附12小时 Hanks液清洗细胞 加入病毒生长液，3335度培养箱培养 24小时后，观察细胞病变。当细 胞病变为3+或4+时，即75100% 细胞出现病变时进行收获，收获 之前将细胞冻融12次，以提高 收获标本的病毒滴度。即使无细 胞病变也应该于第7天收获 （细胞 病变情况：细胞病变的特征是细 胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细 胞核固缩或破裂，严重时细胞部 分或全部脱落 ） 根据使用的细胞瓶的大小，决定接种 量，一般的小细胞瓶接种0.5ml的临 床标本 流程图 MDCK细胞病毒分离 lCPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差 异、感染量的大小

11、和MDCK细胞的敏感性 有关 l每日观察细胞病变(CPE) l标本接种后7天还未出现CPE，维持液经HA 试验阴性者，继续盲传12代后，HA试验 仍为阴性者，则MDCK细胞病毒分离为阴 性，标本可弃去 细胞病变图 鸡胚病毒分离 标本接种于标本接种于9 9日龄鸡胚日龄鸡胚 33333535培养培养7272小时小时 检卵 标本准备 鸡胚分离方法-试剂准备 1) 911日龄鸡胚 2) 照蛋灯 3) 70%75酒精 4) 1ml 一次性注射器 5) 鸡蛋开孔器 6) 无菌胶布或蜡 7) 10ml 试管和试管架 8) 10ml 移液管或1ml移液器及无菌吸尖 9) 无菌镊子 10) 无菌眼科剪 鸡胚分离

12、方法-标记鸡胚 检视标记鸡胚 用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部 的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育 不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉 接种病毒方法 单腔接种 盲种 双腔接种 灯下接种 开窗接种 鸡胚分离方法 鸡胚分离流程（1） 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样 本接种3个鸡胚 用70%75酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm 窗口 用注射器吸200l处理过的临床

13、标本，装上16 号针头 从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让 液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚 的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前， 用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚 随着针头的拨动而动，即可注射100l标本。将针头退出至 寸，将另外100 l标本 注入鸡胚尿囊腔 鸡胚分离流程（2） 用同一注射器和针头将同一标本依上法接种 另外的两枚鸡胚 将针头弃于合适的生物安全装置中 用消毒过的医用胶布封口 3335oC 温箱培养鸡胚23 天。临床采样 标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚 生长情况，2

14、4小时内死亡的鸡胚，认为是非 特异死亡应弃去 鸡胚分离流程（3） 收获尿囊液和羊水 鸡胚在收获前应4过夜或至少放置4小时 标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致 用70%75酒精消毒鸡胚顶部 用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊 膜。用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收 集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水 放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个 鸡胚的羊水合并 鸡胚病毒鉴定 l 经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继 续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚 病毒分离为阴性，标本可弃去 鸡胚收获HA试验 病毒鉴定 红细胞凝集 红细胞凝集抑制试验 病毒鉴定流程 红细胞

15、凝集试验 4个凝集单位配制“回滴” 红细胞凝集抑制试验 判定流感病毒型别 红细胞凝集试验（HA） l MDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚 鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（HA），确定病 毒滴度 l 原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有 能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋 白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这 两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生 凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结 合后，可以抑制凝集现象出现 A H B C D E F G 100ul病毒液 50ul 50ul50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul50ul50ul 50ul 50ul 稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液 50ulPBS 稀释病毒 加入配制好 的红细胞悬 液 充分混匀， 置室温孵育 30-60分钟 观察记录结 果 病毒 原液 1：2 1：128 HA： 32 HA128 HA： 4 红细胞凝集试验（HA） lHA滴度8，进行红细胞凝集抑制（HI） 试验；HA滴度8者，继续在敏感的MDCK 细胞系或鸡胚上进行传代培养，使其HA滴 度8后，再进行HI测定 l若传12代后，HA滴度仍8者，可