《组织细胞培养技术》课件

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1、 组织细胞培养技术 授课教师 左 丽 贵阳医学院免疫学教研室 2008年4月10日 第三章 培养用液 培养用液是维护组织细胞生存、生 长及进行细胞培养各项操作过程中所 需的基本溶液。主要包括平衡盐溶液 、常用试剂及培养基三大类，培养基 又分为天然培养基与合成培养基. 平衡盐溶液（balanced salt solution ， BSS）具有维持渗透压，调控酸、碱 平衡的作用，并可供细胞生存所需的能 量和无机离子成分，另外尚可用作洗涤 组织、细胞以及配制各种培养用液的基 础溶液。常用试剂是制备细胞、培养细 胞及检查细胞所必需的，为细胞培养提 供了方便、有利的条件。 w 水不仅是细胞的主要成分，也

2、是细胞 赖以生存的主要环境，营养物质、代谢 产物都必须溶解在水中，才能被细胞吸 收和排泄。体外培养细胞对水的质量非 常敏感，要求很高。水的纯度不够,即使 有害元素含量极少对细胞也会产生不利 的影响，有时引起细胞中毒死亡。 因此配制所有的培养液和各种溶液 应使用纯化水。组织培养必须使用玻 璃蒸馏器制备的三次蒸馏水。二次蒸 馏水或一次蒸馏水可用以清洗器皿或 配制一般洗液。 w 离子交换水装置 此装置用离子交换树脂可有效地去除离 子，所制得的水称为去离子水。制取去 离子水不用燃料、成本低、水质好、操 作简便，但不能去除非离子物质或有机 物质，因此组织培养中很少使用，仅用 于冲洗玻璃器皿等。 w 二、

3、蒸馏水装置 玻璃蒸馏器制取的蒸馏水符合组织培 养的要求，因用金属蒸馏器不能完全排 除金属离子，故不符合要求。有时为制 取大量高质纯化水，可用去离子水经玻 璃蒸馏器重蒸,组织培养用液需用三蒸水 配制。 蒸馏水一般是现用现制，存放时间不 宜太长，最好不要超过两周。因空气中 的杂质和有毒气体能污染水质，CO2也会 溶解于水，故存放时要将蒸馏水装满贮 存容器，密封瓶口防止空气混入。 第二节平衡盐溶液 w 平衡盐溶液（BSS）主要是由无机盐和 葡萄糖组成，其中无机离子是细胞生命 的必要成分；在维持渗透压、缓冲和调 节溶液pH方面也起着重要作用。Ca2+、 Mg2+能为酶系统的活化提供条件，也是细 胞膜的

4、重要组成成分。葡萄糖等可为细 胞代谢提供能量。 BSS内还含有少量的酚红，作为pH 变化的指示剂，溶液变酸性时呈黄 色，变碱性时呈紫红色，中性时呈 桃红色。 w 目前最常用的BSS是Hanks液、Eagle液和 PBS等。在细胞培养中，BSS用途如下： （1）作为配制培养基的基础溶液： （2）配制各种试液：如配“胰酶”消化液 。 （3）用于洗涤组织和细胞。 w 配制要求: （l）要防止钙的沉淀：应将其中的CaC12 单独配制，并将平衡盐溶液配成浓缩液 ，使其在稀释前不让Ca+与PO42-和CO32-接 触，以免产生不溶解的CaPO4和CaCO3。避 免产生CaCO3的方法是将Na2CO3单独配

5、制 ，使用时现加。 （2）要有良好的缓冲作用： Hanks液和 Earle液都需一定量的CO2平衡。因此应 将瓶盖（橡皮塞）盖紧，以防瓶中CO2逃 逸，使溶液pH增高。pH调整液单独灭菌 时，亦应将瓶盖塞紧，否则NaHCO3受热 分解为NaOH和CO2，失去其调节pH之功能 。 w 为了便于保存和减少有关成分的化学反应， 此液可配成20 x、10 x 和 5 x 浓缩液的储存 液（母液）。 10 x 母液配制法 甲液：取450ml三蒸水依次溶解下列试剂 NaC1 80.0g KCl 4.0g MgSO4 7H2O 2.0g CaC12 1.4g (2H2O 1.85g) 待完全溶解后，补足三蒸

6、水至500ml。 乙液：取 450ml三蒸水依次溶解下列 试剂 Na2HPO4 0.6g（12H2O 1.52g） KH2PO4 0.6g 葡萄糖 10.0g 0.4酚红 50.0ml w 2Hanks使用液配制法 取甲、乙液等量用三蒸水稀释10倍，即成使 用液，用前高压灭菌。 例如配制100 mlHank使用液，则取三蒸水 900m l、甲液50ml、乙液50ml混匀，用110 高压灭菌10min。临用时，用7.5NaHCO3调至 所需pH。 附：为配制上述Hanks液，应先配好0.4酚 红溶液待用。 w 2Hanks使用液配制法 取上述甲、乙液等量用三蒸水稀释10 倍，即成使用液。用前高压

7、灭菌。 例如配制100 ml Hank使用液，则取三 蒸水900ml 加入甲液50ml、乙液50ml混 匀，用高压灭菌15min。临用时，用 7.5NaHCO3调至所需pH。 附：为配制上述Hanks液，应先配好 0.4酚红溶液待用。配制方法如下： 称取0.4g酚红，置玻璃研钵中细研，逐 渐加入0.1mol/L NaOH边滴边研至酚红 完全溶解，记好加 NaOH的量，共加至 11.28ml为止，将研好的酚红液用吸管 移入烧瓶中加三蒸水88.72ml，高压灭 菌15min。 n 第三节细胞培养常用试剂 细胞培养常用试剂主要包括分离组 织和分散细胞用的细胞分离液（消化 液）、调整培养液酸碱度的pH

8、调整液 、防止培养过程中发生污染的抗生素 溶液、指示酸碱度（pH）的酚红溶液 、检查细胞和观察研究细胞用的各种 染液等。 w 一、细胞分离液（消化液） 常用的细胞分离液有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸 二钠（EDTA）和胶原酶等，它们在制备原代细 胞时可消化组织、分散细胞，在传代细胞时使 细胞脱离生长表面（瓶壁）和使细胞团离散成 单个细胞。它们可以单独使用，也可按一定比 例混合使用，这主要取决于所培养细胞的要求 。 胰蛋白酶 w 主要来自牛或猪的胰脏，淡黄色粉末，易 潮解，应放置冷暗干燥处保存。主要作用是使 细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。其活性是 用水解酪蛋白的能力表示，常使用1：125和1 ：25

9、0，即1份胰酶分别能解离125份和250份酪 蛋白,胰酶的离散作用与细胞的种类和特性密 切相关。不同细胞系对胰酶溶液的作用浓度、 温度和时间等的要求也不一样。 浓度大、温度高、作用时间长对细胞的 分离能力也越大，但超过一定限度也会 损伤细胞、胰酶在pH80，温度37时 ，作用力最强。Ca+、Mg+ 血清、蛋白 质的存在会降低其活力，可用无Ca+、 M+的溶液配制，需要终止消化作用时， 可加入一些血清或含血清的培养液或胰 酶抑制剂来终止胰酶对细胞的继续作用 。 1和0.25胰蛋白酶溶液的配制 w 将DHanks液用56 NaHCO3调至pH7.2左右 。 w 称胰酶粉末1克于烧杯中，选用少许平衡

10、盐溶 液调成糊状，再补足至100ml，搅拌均匀，置 室温4小时或冰箱内过夜、并不时搅拌振荡。 w 选用滤纸过滤，再用无菌玻璃滤器(G6）或蔡 氏滤器（EKS2，EKS3）滤过除菌，按5ml（或 1ml）分装小管，盖紧瓶盖，置低温冰箱保存 备用。 临用时将其用D-Hanks液稀释成1:3（1份胰 酶加3份D-Hanks），即得到0.25的胰蛋 白酶溶液。胰酶溶液较酸，使用前再用5 6的NaHCO3调pH至7.2。 乙二胺四乙酸钠（EDTA） 胰酶一 EDTA消化液 pH调整液 w 为了营养成分稳定和延长贮存时间， 在配制营养液时都不预先加入NaHCO3， 而在使用前再加入。故NaHCO3都是单独

11、 配制，高压灭菌。此外，为了维持培养 液恒定的pH，以利于细胞的生长和增殖 ，还可利用HEPES强缓冲液。 合成培养基大都呈弱酸性，而细胞生长的 最适pH为7.07.2，可忍耐的pH范围6.6 7.8。pH到7.6时，细胞虽有代谢但不再 分裂增殖，故使用培养基时要调整pH，并 注意培养过程中的pH变化以及时换液。常 用的pH调整液是NaHCO3、HEPES等。 NaHCO3溶液 w 常用的浓度有 7.4、5.6、 3.7。 配制时用三蒸水溶解后，滤过除菌，分装 小瓶，盖紧瓶塞，于4或室温保存。有 的实验室用高压灭菌，虽有部分NaHCO3被 破坏，但操作简单方便。调节pH时， NaHCO3要逐滴

12、加入，并不时摇动培养液， 以防止加入过量。当pH值过高后，可用灭 菌的10醋酸溶液或通入CO2气体调节。 HEPES w 为了较长时间恒定pH，可使用缓冲能力 较强HEPES（N2oxyethylpiperazine N-2-ethanesulfonic acid，N- 2-羟 乙基派嗪- N- 2-乙磺酸），使用的终 浓度为1050mmol/L，可以根据缓冲能 力的要求而定。 HEPES的分子式为：C8H18O4N2S，分子量 为238。HEPES可按所需的浓度直接加入 到配制的培养液中，再过滤除菌。每 1000ml培养液中加入2.38克HEPES，待 溶后用l mol/L NaOH 调pH

13、至7.07.2 ，滤过除菌后使用。此时HEPES的使用 浓度为10 mmol/L。亦可配成 100 x 贮 存液（l molL），使用前取 99ml培 养液加入 lml贮存液，最终应用浓度仍 为10mmolL。 w l mol/L（100 x）HEPES贮存液配制方法 ： w 取23.8g HEPES溶于 100ml双蒸水中 ，用ll mol/L NaOH调pH至7.5一8.0后， 过滤除菌，分装小瓶（2ml瓶），4 或-20保存。 抗生素液 w 在离散细胞或培养细胞过程中，试液中 加入适量抗生素，可预防操作不慎而产 生的污染。常用的有青霉素、链霉素、 卡那霉素、庆大霉素、二性霉素等。常 配成

14、100 x 或200 x 于使用浓度的盐溶 液内，分装小瓶，冷冻保存。使用前加 入到培养液内，每小瓶最好一次用完。 配制 w 以青霉素、链霉素为例，配制如下： 青霉素（钠盐）100万u 链霉素（双氢）l.0g （100 000g） 溶于无菌三蒸水100ml，每毫 升含青霉素10 000u，链霉素10 000g; 分装 小瓶，20冰冻保存。 w 使用： 99ml培养液中加入青、链霉素混合 液lml，最终浓度为青霉素100uml，链霉素 100gml。 w 使用金霉素时须用预热37的三蒸水溶解呈 清澈的琥珀色。制霉菌素几乎不溶于水，故配 制成悬液。 四、L-Glutamin溶液 w 制备： w L

15、Glutamin 6g （分子量14615） 三蒸水 200ml （1）滤过除菌； （2）分装； （3）一20保存； （4）使用时每100ml培养液加 l ml。 第四节常用培养液 w 培养基可分为天然培养基和合成培养基 。天然培养基，主要来自动物体液或从 组织分离提取制备的，其营养成分较高 ，但成分复杂，个体差异较大，来源也 有一定的限制。合成培养基是根据天然 培养基的成分，用化学物质模拟合成的 ，具有一定的组成，是较理想的培养基 。 但对动物细胞来说，它只能维持细胞 的生存，要想使细胞生长和繁殖，还需 补充天然培养基，即两者混合在一起使 用，效果更好。合成培养基的出现，促 进了组织培养的发

16、展，避免了生物差异 的影响，细胞生长健康透明，延长了体 外存活的时间，价廉易制取。 一、天然培养基 w 天然培养基（natural media）包括：血 清、组织提取液等。血清是细胞培养中最 常使用的天然培养基。血清中含有许多能 维持细胞生长增殖不可缺少的成分，如蛋 白质、多肽、激素及各种氨基酸、葡萄糖 、酮酸等营养成分。 w 种类：分人血清和动物血清两大类。细 胞培养中最常用的是动物血清，来自牛 、马、兔等动物，其中牛血清比马血清 用得更广泛。牛血清分为胎牛血清（ fetal bovineserum， FBS）和小牛血 清（calf serum， CS）两种。 FBS是经剖腹从母牛子宫中取出的胎牛中 分离到的血清，价格贵；CS是从刚出生 但尚未哺乳的小牛中分离到的血清。目 前市售的牛血清质量不一，购买之前应 通过细胞培养进行选择试验，观察细胞 生长增殖与否。也可以用克隆形成率和 细胞生