免疫检测的自动化及标准化

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1、免疫检测的自动化及标准化 蚌医一附院检验科 王凤超 免疫分析技术 经典的免疫分析技术 凝集反应、沉淀反应、溶血反应、补体结合实验 特点：成本低、技术简单、结果易于判断，但不易于 实现自动化。 现代的免疫分析技术 荧光免疫标记、放射性免疫标记、酶免疫标记、镧系 （稀土）元素免疫标记、临床化学免疫分析技术、发 光免疫标记、流式免疫微球技术及生物传感器技术等 。 特点：灵敏、特异、快速、易于测定及实现自动化。 荧光免疫标记技术 1950年Coons合成异硫氰酸盐(荧光染料)，用作标记抗体做 小鼠组织切片染色，开创了免疫荧 光技术（ immunofluorescence techniques）,又称为

2、荧光抗体技术（ Fluorescent antibody ） 传统免疫荧光技术：荧光显微镜下分析荧光状态、分布， 及流式细胞仪，荧光偏振分析 现代免疫荧光技术 ：荧光激活细胞分类仪（ FACS )，荧光 自动化分析测试仪 、时间分辨荧光技术（TRF ) TRF：以稀土离子(镧系元素）标记抗原或抗体，稀土原子 具有荧光发射峰谱范围窄、激发光波长范围宽的特点，有利 于增强荧光的特异性，提高分辨率；排除非特异性荧光的干 扰、降低本底荧光。具有标记物制备简便、有效期长、不污 染环境、操作流程短、标准曲线线性范围宽，高灵敏、高特 异、有效期长、易于实现自动化、应用范围广等优点。 放射性免疫标记技术 19

3、58年，美国科学家贝尔森和雅洛把放射性“标记 ”引入免疫分析，两人也因此获得了1977年的诺贝 尔生理学奖。早期的研究都是以I131 (射线和射 线)作为标记的，目前用的是高纯度、高活性的I125( 弱射线)，以减少放射性核素对人体健康潜在的影 响。 优点：高灵敏、高特异 缺点：同位素半衰期及污染问题、试剂有效期短、 反应时间长、批间批内的差异、标准曲线稳定性差 、不易实现自动化。 从90年代开始放免分析在国际上每年以10的速度 下降。随着时间的推移，将会被新的技术方法取代 。 磁微粒分离技术 2-3um的超顺磁性磁微粒作为实现免疫反应结 合物与反应混合物的分离载体 其核心制造技术是在超顺磁性

4、磁微粒的表面大 量偶联了特异性结合抗体 参加反应后的免疫磁微粒通过一个外加磁场吸 附下来，然后把其它杂质去掉 免疫反应在反应状态上，相比微孔板式的固相 反应(固液界面反应)优化成了准液相反应，反 应面积、几率大大增加，其反应速度大大加快 。 制备的试剂具有灵敏度高、特异性强、稳定性 好、结果准确可靠的优点 动力粒子 : 酶免疫标记技术 酶免疫标记技术 酶免疫测定 酶免疫组化技术 均相酶免疫测定 异相酶免疫测定 液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 （ELISA） 酶免疫分析的自动化 酶免分析系统的标准化，自动化与网络化，是全实验 室自动化（Total Laboratory Automation， T

5、LA)系统 的重要组成部分，包括样本(前处理)模块、酶免分析( 后处理)模块、软件信息模块等，是迈向全面实验自动 化建设的重要基石。 酶免疫分析的自动化 样本处理自动化 主动标本识别条码阅读功能；更高的标本处理效率;更少 的劳动强度;职业暴露机会最小化；通过减少人为失误、 改善加样精度与准确性来改善分析质量，采用批量（ batch )或随机(random access)进行多种组合与多种模式 的检测 全自动酶免分析系统 多任务、多通道，完全实现平行过程处理，特别是自由 任务资源管理系统，可以随时增加(急诊)任务菜单，实 现最优反应过程(实验质量)和最大化分析生产力( throughput) 。

6、根据处理模式的不同，全自动酶免分析系 统可分为两类，即一体机: 如EVOLIS. Alisei. Tecan， Personal LAB，变色龙等;分体机: 如AT和费米；斯达尔 和费米;RSP和MPP3000等。 Microlab AT plus 2增强型全自动 样本处理机 采用主动条码识别 12通道加样针 主动抛弃式加样头 容积从 10一300ul 96个标本加样速度小于 5分 钟 可批量处理最多5块微板。 FAME (费米)全自动酶免分析系统 硬件上采用综合模块化设计，并行工作模 式、双孵育双洗板、单读数模块 可容纳10块板，24个试剂位，30个密闭式 孵育位 采用液体水平探测(LLD

7、)、体积与重量传 感、光学位置传感等技术，实现了真正的 全过程控制( TPC )，尤其是专利的洗液传 感器，确保了最佳洗板效果。 软件上采用 全自动GMP/GLP规范系统，如 全面的系统跟踪记录（Traceability）与系 统追溯（Traceability），标本试剂加样 校验 ( Sarnple verification) 及“自由任务 管理”等功能。 哈美顿的辉煌之星 酶免之星 TECAN大型全自动酶免一体机 采用条码识别和试管架定位两种 标本识别模式，可调式四维方式 运动传输 加样头则使用一次性加样头与 TEFLON钢针任意组合 加样速度高达1956孔/小时，试 剂分配速度为7680

8、孔/小时 可同时在线20项试验，每块板内 分别进行12项试验。恒温孵育器 多达2个，每个孵育器至少可容 纳6个板 读板速度达6秒/板，4种洗液在 线模式，清洗液量系统监控 试剂全开放 BRIO开放式全自动酶免系统 中心处理系统为双试剂和样本盘模式 ，可容纳4块微孔板，120样本，最大 运行9项 测试。 测试模式可为随机插入式或成批处理 式。 双机连机型加样速度达768标本h， 试剂分配速度为 2300孔h 孵育及振荡模式均采用独立控制的孵 育及振荡位，温度范围25-45C，具有1 C增量和/或1300rpm振荡。 原采血试管、试剂、缓冲液、清洁液 ，废液瓶均配有液面自动检测系统。 缺点是读数器

9、（酶标仪）独立于机外 。 Alisei全自动酶免分析系统 中心处理系统采用独特的滑轮传 送模式，内含六块微孔板 具有双针加样系统，共配有4个 高精度的注射器，加样速度达 700标本/h，试剂分配速度为 1900孔/h 系统利用多批次处理方式，每天 可处理20块微孔板的不同项目测 试，同时在线16个不同项目。 独立的孵育振荡位多达6个，试 剂开放 具有时间优化管理功能 Personal LAB全自动酶免分析系统 可同时处理两块酶标板 最多运行6种不同项目192个检 测 机械手臂能够根据样本具体情 况，选择使用金属针或者一次 性的塑料加样头，加样速度小 于14分钟(96个样本)，试剂分 配速度小于

10、3分 钟(96孔) 系统拥有两个独立的封闭式温 育仓，一个清洗站和两个读数 平台，专利的洗板头为8个加液 器和8个吸液器组成 探针的内外双冲洗可最大限度 地减少交叉污染。 Nexgen Four全自动酶免分析系统 双臂四针，可并行运行4块96孔酶标 板 系统由1个中央样品装载盘，2套独 立三维加样臂、4个独立孵育舱、 48通道读数器、2套洗板装置组成 。 拥有可实时互换的双重加样针(金属 加样针和一次性加样头)，并行加样 本速度800孔/h，加试剂速度 3 800孔/h。 该仪器由内、外2套计算机管理， 先 进的运行软件基干WINDOWS XP和 NET架构设计。 仪器还可以增选全自动过敏原分

11、析 装置。 EVOLIS全自动酶免分析系统 EVOLIS是一个全面开放的全自 动酶免系统，内置多种模式的 条形码解读功能，用户可任意 设置或修改ELISA试验涉及到的 所有参数。 可同时处理四块酶联反应微孔 板，每板多达12种测试,同时上 样180个标本;系统配置八个滤 光片同时对多块板进行不同组 合的操作 样品和试剂加样针采用一次性 加样头 具有液面及血凝/气泡感应检测 器；4个独立的孵育盘，3种不 同的洗液，灵活多变的微孔板 清洗方式 变色龙开放式全自动酶免系统 变色龙是一套全自动、开放式，连 续、多批次酶免分析系统。高度灵 活的加样功能，可在加样针中进行 稀释，加样速度 9分钟/96孔，

12、加 试剂速度为2.5分钟/96孔，可放置 188个样品管和预稀释管120个加样 用Tips头、8个预稀释液56 个对照 或标准品。 一次性Tip头和固定加样针自由互 选，独有的微孔交叉吸液使残留液 减至2 ul以下。 独立的温控板位多达4个，可进行 独有的振荡式加盖孵育。 小结 目前，部分全自动酶免分析系统已具备全 过程控制（TPC）系统，符合GMP，GLP 硬件和软件规范，可以全自动生成实验操 作记录( Traceability )和系统追溯记录 (Trackability )，这些技术进步不仅有助 于建立信息化的质量控制( QC )和 质量保 障( QA）体系，而且在医疗责任举证倒置 的实

13、践中，这些记录或证据将可以阐明酶 免实验的正确性和可靠性，以防患各种纠 纷的产生。 化学发光免疫测定 化学发光免疫测定的分类 1 发光酶免疫测定（间接化学发光） AP /OH HPO4 2 光 化学发光免疫测定的分类 2 直接化学发光 + 光 化学发光免疫测定的分类 3 电化学发光 电化学发光 反应原理:化学发光剂三联吡啶钌Ru (bpy)32+和电子供体 三丙胺(TPA)在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化 反应。二价的Ru (bpy)32+被氧化成三价，这是一种强氧化 剂,TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA十.，它很不稳 定，可自发地失去1个质子(H十)，形成自由基TPA. ，

14、这是 一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的Ru (bpy)33+使 其形成激发态的 Ru (bpy)32+ ，。激发态的三联吡啶钌很 快发射出一个波长620nm的光子，回复成基态的三联吡啶钌 。这一过程可以在电极表面周而复始地进行，产生许多光子 ，使光信号增强。 基态 激发态 美国雅培公司的AXSYM全自动快速 酶免疫分析系统 技术原理：MEIA、FPIA、ICIA 标记物：碱性磷酸酶 包被技术：微粒子包被 分离技术：纤维网分离 发光剂：4MUP 发光诱导：酶催化底物发光 检测方法：夹心法和竞争法 检测速度：70Th 试剂位：20 灵敏度： 1015 重复性：批内5，批间10 美国雅培公司的

15、I2000SR 技术原理：化学发光 标记物：吖啶酯 包被技术：磁微粒子包被 分离技术：磁性分离 发光剂：吖啶酯 发光诱导：改变PH值 检测方法：夹心法和竞争法 检测速度：200Th 试剂位：25 灵敏度： 1015 重复性：批内5，批间10 美国拜耳CS 180SE和ACS CENTAUR全自 动化学发光免疫分析系统 技术原理：化学发光 标记物：吖啶酯 包被技术：磁微粒子包被 分离技术：磁性分离 发光剂：吖啶酯 发光诱导：改变PH值 检测方法：夹心法和竞争法 检测速度：100Th 试剂位：13 灵敏度： 1015 重复性：批内5，批间10 德国全自动化学发光免疫分析仪 LIAISON 技术原理

16、：直接化学发光技 术 标记物：异鲁米诺 包被技术：磁微粒子包被 分离技术：磁性分离 发光剂：异鲁米诺 发光诱导：改变PH值 检测方法：夹心法和竞争法 检测速度：180Th 试剂位：15 灵敏度： 1015 重复性：批内5，批间 10 Vitros ECI全自动增强化学发光酶免分 析仪系统 技术原理：增强化学发光技术 标记物：辣根过氧化物酶标记 包被技术：链霉亲和素包被的子弹头 型塑料小孔管为固相载体包被 分离技术：直接清洗分离 发光剂：鲁米诺 发光诱导：酶催化底物发光 检测方法：夹心法和竞争法 检测速度：70Th 试剂位：15 灵敏度： 1015 重复性：批内5，批间10 Access2全自动微粒子酶放大化学发 光免疫分析系统 技术原