试验专题模块三血液生化检验_生物化学与分子生物学

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1、实验专题模块三 血液生化检验 p血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 p血清尿素氮的测定 p血液是在心脏和血管腔内循环流动的一种组织。成人的血液 约占体重的十三分之一，相对密度为1.0501.060，pH值为7.3 7.4，渗透压为313 mmol/L。 p血液由血浆和血细胞组成。血浆内含血浆蛋白（白蛋白、球 蛋白、纤维蛋白原）、脂蛋白等各种营养成分以及无机盐、氧 、激素、酶、抗体和细胞代谢产物等。 p利用生物化学的方法，检测存在于血液中的各种离子、糖类 、脂类、蛋白质以及各种酶、激素和机体的多种代谢产物的含 量，叫做血生化检查。 p在正常生理情况下，其各种化学成分的含量非常恒定。但是 ，机体的生理变化和

2、病理情况，可导致血液的某些化学成分的 含量发生较大的变化。所以分析血液的化学成分可以了解人体 物质代谢的状况，并协助诊断或者判断预后。 p本专题将介绍血清蛋白与血尿素氮等两种生化指标的检测， 使同学们对临床生化检验有一个初步的了解。 实验一 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 一、实验目的 1. 掌握分离血清蛋白的基本原理及其临床意义 。 2. 了解醋酸纤维薄膜电泳的方法及相关仪器的 操作。 二、背景与原理 血清蛋白的pI都在7.5以下，在pH为8.6的巴比妥缓 冲液中以负离子的形式存在，分子大小、形状也各 有差异。所以在电场作用下，可在醋酸纤维薄膜上 分离成A、1、2、和五条区带。电泳结束后， 将醋酸

3、纤维薄膜置于染色液，使蛋白质固定并染色 ，再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别 用剪刀分离出来，将其溶于碱液中，进行比色测定 ，最后计算出各区带蛋白质的百分数。也可将染色 后的醋酸纤维薄膜透明处理后在扫描光密度计上绘 出电泳曲线，并可根据各区带的面积计算各组分的 百分数。 + 白蛋白 (A) 1 2 血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负 离子形式存在，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离 成A、1、2、和五条区带。 蛋白名称等电电点分子量 白蛋白4.8869000 5.06 1：20000 2：30000 5.1290000-150000 6.85-

4、7.50156000-300000 p 醋酸纤维 素（二乙酸纤维 素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗 透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电 泳的支持物，具有 用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂 蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 p 醋酸纤维 素薄膜经1,4二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透 明，因而可得背景为无色的电泳图谱 。 醋酸纤维素薄膜的特性 四、 实验操作 1. 准备与点样： 1） 将薄膜切成2.58cm的小块，在薄膜无光泽面距一 端1.5cm处用铅笔划一线，表示点样位置。 2） 将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上（ 缓冲液盛于培养皿中），使膜条自然

5、浸湿下沉。 3） 将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出， 用滤纸吸取多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻 片上，使点样线空架。 4） 用血色素吸管吸取人新鲜血清35ul，涂于宽2厘 米的点样器末端处，或用点样器在盛有血清的小烧杯 中蘸一下，使其末端粘上薄层血清，然后紧按在薄膜 点样线上，待血清全部渗入膜内，移开点样器。 2. 电泳: 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（ 即点样面）向下，点样端置于阴极。槽架上以四层滤 纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5分钟后通电 ，电压为10V/cm长（指膜条与滤纸桥总长度），电流 为0.40.6mA/cm宽，通电一小时左右关闭电源。 3.

6、染色: 通电完毕后用镊子将膜取出，直接浸于盛有氨基黑 10B的染色液中，染5分钟取出，立即浸入盛有漂洗液 的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用 滤纸吸干薄膜。 4. 定量： 取试管6支，编好号码，分别用吸管吸取0.4N氢氧化钠4ml 。剪开薄膜上各条蛋白色带，另一空白部位剪一平均大小的 薄膜条（作为分光光度法调零管），将各条分别浸于上色述 试管内，不时摇动 ，使蓝色洗出。约半小时后，用分光光 度计进 行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对 照，读取白蛋白、1、2、球蛋白各管的吸光度值A。 5. 计算: 光吸收总和A总AA+A1+A2+A+A 各部分蛋白质的百分数为： 白蛋

7、白%= (AA / A总)100%; 1球蛋白%= (A1/ A总)100%; 2球蛋白%= (A2 / A总)100%； 球蛋白%= (A / A总)100%； 球蛋白%= (A / A总)100% 临床意义 p 正常值： 白蛋白： 5772% 1球蛋白：25% 2球蛋白：49% 球蛋白： 6.512% 球蛋白： 1220% p 急性肝炎：发病早期蛋白质电泳无变化，发病两周后白蛋白、2 及球蛋白减少，球蛋白增高。 p 慢性肝炎：球蛋白升高，白蛋白下降较急性肝炎显著。 p 肝硬化：白蛋白、1、2球蛋白均明显下降，球蛋白极度升高 ，甚至A/G比值倒置。 p 肾病综合征时，白蛋白降低，2 、球蛋白

8、升高。 实验二 血清尿素氮的测定 一、实验目的 1. 掌握血尿素氮的定义及其测定的意义。 2. 了解二乙酰一肟显色法的原理与操作。 二、背景与原理 尿素的生成是肝脏的解毒功能之一。通常肾脏为排泄尿素的主要器官 ，尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收，因此在血液中会有少 量的尿素存在，一般用血尿素氮（BUN）来衡量。 肾小管内尿流速越快，尿素的重吸收就越少，也即达到了最大清除率 。如果肾功能出现了损害，则有可能导致尿素排出减少，或者是重吸 收增多，使得BUN升高。和血肌酐（SCR）一样，在肾功能损害早期 ，血尿素氮可在正常范围。当肾小球滤过率下降到正常的50%以下时 ，血尿素氮的浓度才迅速升高

9、。正常情况下，血尿素氮与肌酐之比（ BUN/Scr）值约为10.1，高蛋白饮食、高分解代谢状态、缺水、肾缺 血、血容量不足及某些急性肾小球肾炎，均可使比值增高，甚至可达 2030；而低蛋白饮食，肝疾病常使比值降低，此时可称为低氮质血 症。 血尿素氮的检测方法有很多，在本实验中我们将使用二乙酰一肟显色法。该 方法的原理是，尿素与二乙酰在酸性环境中加热可缩合成红色的二嗪衍生物 ，颜色深浅与尿素的含量成正比，可通过分过光度法获得尿素含量。因二乙 酰不稳定，故用二乙酰一肟来代替。二乙酰一肟与强酸作用，可产生二乙酰 ，进而再与尿素反应，过程如下： 反应在强酸中进行，产生的羟胺是干扰物质，所以须用氧化剂将

10、其氧化除去， 可用的氧化剂有过硫酸盐、砷酸、过氯酸、氯胺T以及一些阳离子等。另外， 在显色反应中产生的复合物存在着对光不稳定的问题。加入硫氨脲既能提高尿 素与二乙酰反应的灵敏度，又能增加其显色的稳定性。硫氨脲如果结合三价铁 离子或镉离子一起使用更能提高灵敏度。这样就可以进不除血清蛋白的超微量 尿素氮测定。 四、实验操作 试试管编编号1234 尿素氮标准液 （ml） 1234 蒸馏水（ml）5432 尿素氮的浓度 （mg/100ml） 10203040 系列标准溶液的配制 测定液的配制 试管编号123456 蒸馏水（L）0000200 分别从上表1-4管吸取液 体加入对应编号管（L ） 2020

11、202000 血清样品（L）20 酸性试剂（mL）555555 2% 二乙酰一肟（mL ） 0.50.50.50.50.50.5 混匀后置于沸水中水浴12分钟。 置冷水中冷却5分钟后，用540nm进行比色，以5号管作 为空白，读取各管光吸收读数。 将所得读数作纵座标与相应尿素氮浓度作横坐标在座 标纸 上作图，绘成标准曲线 查标准曲线，得待测血清中尿素氮含量。 五、注意事项 1.如血浆或血清尿素氮浓度超过40mg时，则 必须将标本用生理盐水稀释后再操作，结 果乘稀释倍数即可。 六、临床意义 1. 正常值范围：519mg/100ml 2. 可能临床提示： 1）血液尿素浓度增高分生理性和病理性因素两

12、方面。 A生理因素：高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。血 清尿素浓度男性比女性平均高0.30.5mmol/L，随年龄增加有增高倾向。 成人日间生理变异平均为0.63mmol/L。 B病理因素 a. 肾前性：最重要的原因是失水，因血液浓缩使肾血流量减少，肾小球滤 过率减低而致血液尿素浓度增加。 b. 肾性：肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾 炎等影响肾小球滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高。 c. 肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿素含量增高，如 前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。 2）血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高

13、糖饮食者外，常见于肝功 能衰竭患者。 课堂分组讨论 患者女性，47岁，农民。因反复发作性昏迷半年，近发作7 小时入院。体检：中度昏迷，肝未触及，无瘫痪体征。心电 监测以及头颅CT均未发现明显异常。立即使用甘露醇静脉 滴注，3小时后患者苏醒。追问病史，患者来自血吸虫病区 ，3年前因脾脏肿大行脾切除术。每次昏迷前均有进食高蛋 白食物史，但未引起重视。本次发病前在亲戚家进食鸡蛋两 个，烤鸭约半斤以及少量猪肉。肝功能检查：血氨 150umol/L，血清白蛋白38.2g/L，球蛋白27.4g/L，总胆红 素15.2umol/L,ALT 135U/L, AST 45U/L.。B超显示，血吸虫 性肝纤维化。 问题讨论： 1. 患者高蛋白饮食与肝性脑病发病的关系如何？ 2. 肝性脑病的分子机制。 知识回顾知识回顾 Knowledge Knowledge ReviewReview