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1、实验四实验四 特殊染色法特殊染色法 实验目的要求 了解抗酸染色法、芽胞染色法的原理了解抗酸染色法、芽胞染色法的原理 熟悉抗酸染色法、芽胞染色法的方法以及熟悉抗酸染色法、芽胞染色法的方法以及 意义意义 实验材料与方法 材料材料: : 菌种：卡介苗、枯草杆菌培养物菌种：卡介苗、枯草杆菌培养物 染液：抗酸染色液、芽胞染色液染液：抗酸染色液、芽胞染色液 其他：玻片、接种环、酒精灯其他：玻片、接种环、酒精灯 无菌生理盐水、显微镜等无菌生理盐水、显微镜等 方法：方法： 细菌涂片的制作：涂片、干燥、固定细菌涂片的制作：涂片、干燥、固定 染色：抗酸染色法、芽胞染色法 染色：抗酸染色法、芽胞染色法 油镜使用：观
2、察染色结果并记录油镜使用：观察染色结果并记录 （一）抗酸染色法 抗酸性细菌如结核杆菌等分枝杆菌属细菌，抗酸性细菌如结核杆菌等分枝杆菌属细菌， 细菌细菌细胞壁有很多细胞壁有很多脂类物质脂类物质，石碳酸复红加，石碳酸复红加 温染色后，其中的温染色后，其中的分枝菌酸分枝菌酸与石碳酸复红结与石碳酸复红结 合成牢固的复合物，能够抵抗盐酸酒精的脱合成牢固的复合物，能够抵抗盐酸酒精的脱 色，使菌体保留红色，故称抗酸染色法。色，使菌体保留红色，故称抗酸染色法。 其他非抗酸菌和组织细胞因不能抵抗盐酸酒其他非抗酸菌和组织细胞因不能抵抗盐酸酒 精的脱色，被脱成无色，后经碱性美兰染色精的脱色，被脱成无色，后经碱性美兰
3、染色 后染成兰。后染成兰。 1 1、原理、原理 2、抗酸染色方法 染液组成：染液组成： 石碳酸复红、石碳酸复红、3 3盐酸酒精、碱性美兰染液盐酸酒精、碱性美兰染液 染色方法：染色方法： 石碳酸石碳酸 复复 红红 初染初染 3 3盐酸酒精盐酸酒精 脱脱 色色 碱性美兰碱性美兰 复复 染染 加温染加温染5 5分钟分钟 1-2min1-2min 影响抗酸染色的关键步骤是影响抗酸染色的关键步骤是脱色脱色 冷却冷却后水洗后水洗水洗水洗 水洗水洗 干燥干燥 13min13min 注意事项 1、加温染色时：在火焰上方保持一定高度 ，加热至出现蒸气（注意不能使染液沸腾 ），如此反复23次（约5min）。在加热
4、 过程中要防止将染液烘干，应及时添加染 液。 2、脱色时：用3%盐酸酒精脱色，直到流 下的液体无色为止，进行水洗。 3、抗酸染色结果及意义 结果：结果： 红色红色抗酸染色阳性菌抗酸染色阳性菌 兰色兰色抗酸染色阴性菌抗酸染色阴性菌 意义：意义： 用于鉴定分枝杆菌属细菌以及某些放线菌用于鉴定分枝杆菌属细菌以及某些放线菌 结核分枝杆菌（抗酸染色） （二）芽胞染色法 芽胞是细菌在不良的环境条件下形成的休眠体芽胞是细菌在不良的环境条件下形成的休眠体。细菌能否。细菌能否 形成芽胞以及芽胞的形状、芽胞的位置、是否膨大等特征形成芽胞以及芽胞的形状、芽胞的位置、是否膨大等特征 是鉴定细菌的重要依据之一。是鉴定细
5、菌的重要依据之一。 由于芽胞壁厚，通透性差，不易着色。为了能使芽胞着色便由于芽胞壁厚，通透性差，不易着色。为了能使芽胞着色便 于观察，特用芽胞染色法。于观察，特用芽胞染色法。 其基本原理是：用着色性强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，其基本原理是：用着色性强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红， 在加热条件下染色，使染料不仅可以进入菌体也可进入芽在加热条件下染色，使染料不仅可以进入菌体也可进入芽 胞内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽胞一经着色胞内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽胞一经着色 难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽胞仍保难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽胞仍保 留初染剂的颜
6、色，而菌体和芽胞囊被染成复染剂的颜色，留初染剂的颜色，而菌体和芽胞囊被染成复染剂的颜色， 使芽胞和菌体更易区别。使芽胞和菌体更易区别。 1 1、原理、原理 2、芽胞染色方法 染液组成：染液组成： 5 5孔雀绿水溶液、孔雀绿水溶液、 0.50.5番红染液复染番红染液复染 染色方法：染色方法： 加数滴加数滴 孔雀绿孔雀绿 染液于染液于 涂片上涂片上 待玻片冷却后待玻片冷却后 水水 洗洗 番红染番红染 液复染液复染 微火加热至染微火加热至染 料冒蒸汽料冒蒸汽 用缓流自流水冲洗用缓流自流水冲洗 维持维持5 5分钟分钟 至流出水无色至流出水无色 水洗水洗 干燥干燥 2min2min 3、芽胞染色结果及意义 结果：结果： 芽胞绿色芽胞绿色 菌体及芽胞囊红色菌体及芽胞囊红色 意义：意义： 用于观察芽胞的形态特征以及鉴定细菌用于观察芽胞的形态特征以及鉴定细菌 。 注意事项 1、加温染色时应及时添加染液，防止染液 干涸。 2、进行水洗时，用细水流冲洗菌膜上方， 让水流淌过菌膜，避免将菌膜冲掉。
