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1、广东药学院 硕士学位论文 微生物酶法生产茶氨酸的研究 姓名：傅锦坚 申请学位级别：硕士 专业：病原生物学 指导教师：胡立勇 20090501 广东药学院硕士研究生学位论文 I 微生物酶法生产茶氨酸的研究 专业：病原生物学 研究生：傅锦坚 导师：胡立勇 中 文 摘 要 茶氨酸是茶叶中的特征氨基酸，也是茶叶的呈味物质之一。它是一种具有 多种生理效应的特殊氨基酸，在食品添加剂方面已有广泛应用，在功能食品方面 崭露头角，在医药方面有待开发，市场潜力巨大。已报道的茶氨酸制备方法中， 微生物转化法是一种发展前景较好的茶氨酸制备方法。 开展茶氨酸的微生物酶法 合成研究具有重要的理论意义和实践价值。 本研究的
2、主要目的是选择地衣芽孢杆 菌作为合成茶氨酸的产酶菌株， 并结合种间耦联 A T P 再生技术系统用于酶法合成 茶氨酸等进行研究，为利用微生物发酵法工业化生产茶氨酸打下基础。主要研究 结果如下： 1 . 产酶菌种：本实验采用- 谷氨酰基转肽酶工业生产菌株地衣芽孢杆菌 （B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ）为生成茶氨酸的产酶菌种。产酶发酵研究表明，此 菌株经产酶发酵后的- 谷氨酰转肽酶活性可达 6 . 3 3 U / m l 。 2 . 茶氨酸转化试验结果：地衣芽孢杆菌的- 谷氨酰基转肽酶具有较好的催 化 L - 谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力
3、。酶法合成茶氨酸的产量为 2 1 g / L 。 谷氨酰胺转化生成茶氨酸的转化率达 3 5 . 2 % 。 3 . 产酶促进剂研究结果：在常规产酶发酵研究基础上，研究了一些产酶促 进剂对产酶发酵和茶氨酸转化的影响。正交试验结果显示，在产酶发酵培养基中 添加磷酸吡哆醛、金属离子 M g 2 + 、M n 2 + 和表面活性剂 T w e e n - 8 0 可有效地提高地衣 芽孢杆菌的产酶能力。- 谷氨酰基转肽酶的活性可达 7 . 4 2 U / m l ，酶法合成茶氨 酸的产量为 2 6 g / L 。谷氨酰胺转化生成茶氨酸的转化率达 4 3 . 6 % 。 4 . 种间耦联 A T P 再生
4、技术研究结果： 本研究将地衣芽孢杆菌的产酶系统和嗜 热脂肪芽孢杆菌A T P 供能系统相耦联建立了一种种间藕联A T P 再生技术生产茶氨 酸。采用该技术进行茶氨酸转化生产，茶氨酸产量达到 3 5 g / L ，谷氨酰胺转化为 茶氨酸的转化率为 5 9 % 。 广东药学院硕士研究生学位论文 II 5 . 固定化细胞技术生产茶氨酸研究结果：高活性的- 谷氨酰基转肽酶产 酶菌株地衣芽孢杆菌经产酶发酵后，用 3 % 卡拉胶于 4 5 包埋，制备成- 谷氨酰 基转肽酶固定化细胞。将固定化细胞产- 谷氨酰基转肽酶系统与 A T P供能系统 耦联后，在催化底物转化生成茶氨酸的同时实现被消耗的 A T P
5、再生，使茶氨酸合 成反应高效率地进行。种间耦联固定化细胞合成茶氨酸的产量为 3 0 g / L ，谷氨 酰胺转化生成茶氨酸的转化率为 5 0 . 3 % 。 本实验所选用的地衣芽孢杆菌为- 谷氨酰基转肽酶的工业化生产菌株，具 有较高的酶活性，该酶用于茶氨酸转化生产具有实用价值。本实验研究所建立的 种间耦联 A T P 再生技术方法，不仅可用于茶氨酸的生产，还可以为其它酶工程发 酵产品的生产提供技术支持。本实验还采用了固定化细胞技术生产茶氨酸，该技 术的应用有利于工业化生产的操作和提高茶氨酸产品质量。 本实验的所有研究为 工业化生产茶氨酸提供了一条有价值的技术路线。 关键词：地衣芽孢杆菌；- 谷
6、氨酰基转肽酶；茶氨酸；酶法；A T P 再生技 术 广东药学院硕士研究生学位论文 i Study on production of theanine by microbal enzymatic method Graduate: jin- jian Fu Speciality: Pathogen Biology Supervisor: professor li- yong Hu ABSTRACT Theanine is the most important free amino acid in tea.Beside its graceful taste,theanine has many fav
7、orable physiological functions.This suggest that demand for theanine will become great as a supplement for improving and maintaining human health.Although several methods for preparing theanine have been reported,they are usually complicated and show unsatisfactory yield.So microbial enzymatic metho
8、d to produce theanine is getting more and more attention.In this study,a sort of microbe- Bacillus licheniformis that can abundantly synthesize theanine was found. We have investigated theanine production from L- glutamine and ethylamin hydrochlorid as substrates by “coupled fermentation with energy
9、 transfer“using Bacillus licheniformis ?- glutamyltranspeptidase.This study has a better instruction for industrial producing theanine of microbial fermentation.The main results were follows: 1.Enzymatic production strains：Bacillus licheniformis ?- glutamyltranspeptidase has a high ability of synthe
10、sis theanine. Enzymatic fermentation study shown that ?- glutamyltranspeptidase activity could be achieved at 6.33U/ml. 2.Theanine transformation test results：Bacillus licheniformis ?- glutamyltrans- peptidase has a good ability of synthesis theanine as a catalyst. The yield of theanine was 21g/L,Th
11、e conversion rate of L- Gln as to theanine reach 35.2%. 3. Enzyme promoters results: On the basis of conventional research about enzyme fermentation, the enzyme fermentation and theanine transformation test shown that some promoters were useful. The orthogonal test shown that,enzymatic fermentation
12、medium with Mn 2+、Mg2+、Tween- 80、pyridoxal phosphate could increase the capacity of Bacillus licheniformis to produce ?- glutamyltranspeptidase. 广东药学院硕士研究生学位论文 ii The ?- GGT activity could be achieved at 7.42 U/ml, The yield of theanine was 26g/L,The conversion rate of L- Gln as to theanine reach 43
13、.6%. 4. Species coupled ATP regeneration study:In this study,a combination of Bacillus licheniformis ?- glutamyltranspeptidase system and Bacillus stearothermo philus ATP energy supply system could successfully synthesis theanine.The yiel d of theanine was 35g/L,The conversion rate of L- Gln as to t
14、heanine reach 59 %. 5.Immobilized cells to produce theanine results:Immobilized Bacillus licheniformis ?- glutamyltranspeptidase could synthesis theanine coupled with ATP regeneration. The yield of theanine was 30g/L,The conversion rate of L - Gln as to theanine reach 50.3%. Bacillus licheniformis ?
15、- glutamyltranspeptidase has a good ability of synthesis theanine. It is a practical value to produce theanine to use ?- glutamyltranspeptidase because of its high activity .In this study, We have established the species coupled ATP regeneration tecnology.It could not only use to produce theanine,bu
16、t also provide technical support to ferment other products.We also established immobilized cells tecnology to synthesis theanine.It is useful to handle industrial tecnology and improve product quality. In this study, all of tecnologies and results will provide a valuable line to produce theanine. Keywords: Bacillus licheniformis ；?- glutamyltranspeptidase； theanine； enzymatic method；ATP regeneration technology 广东药学院学位论文原创性声明 本人郑重声明： 本人所呈交的学位论文，系我个人在导师的指 导下进行研究工作所取得的成果。 除文中已特别加以标注和
