《动物实验技术作业模板》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动物实验技术作业模板（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、有关褪黑素 （有关褪黑素 （MT） 与雌激素 （） 与雌激素 （E） 联合用药对老年性痴呆 （） 联合用药对老年性痴呆 （AD） 影响的研究 ） 影响的研究 姓名：李 XX 学号：XX 专业：XX 联系电话：XX 邮箱地址：XX 国内外研究现状国内外研究现状 AD发病机制及其治疗的研究多年来一直地老年医学、神经病学和神经生物学的热点课 题。随着AD分子生物学的研究进展，近年来对AD发病的细胞分子机制的理解取得长足的进 展。最主要的进展之一是提示了从A（淀粉样蛋白）的前体蛋白APP的加工A的生 成A的沉积到SP（老年斑）形成及其伴随的神经元损害的AD病理过程。A由其前体 （APP）裂解而来。在生
2、理状态的A是可溶性的，可能具有某种生理功能。病理状态下A 为不可溶性，它们聚集和纤维形成，并在神经组织沉积产生毒性作用，在这一过程中机体 过氧化（自由基） 、糖基化作用、炎症反应起了重要作用，A也主要通过自由基发挥其强 的神经毒性作用。脑内有大量A的沉积和SP形成的动物模型也成为模拟AD病理过程的主 要模型之一。 因此，本课题选用以 A沉积，老年斑为主要病理改变的 PDAPP 转基因鼠和加速老化 鼠（SAM-P8）作为动物模型，研究褪黑激素和雌激素对动物模型脑内 A生成、沉积、老 年斑形成等改变及脑内自由基损害的影响， 结合行为学研究。 分析褪黑激素和雌激素对机体 不同年龄阶段老年性痴呆病理过
3、程中的作用，为这二种激素治疗老年性痴呆奠定理论基础。 研究意义研究意义 围绕淀粉样蛋白（A）生成、沉积到老年斑形成这一老年性痴呆（AD）病理机制 主线，自由基过氧化损害加速 A聚集几神经元调亡的要点，本课题利用褪黑激 素 研究腿黑激素和雌激素是否有实效性阻止 AD 的病理过程， 抗自由 基损害，为探讨褪黑激素和雌激素单一和联合用药防治老年性痴呆的用药奠定理论基础。 拟解决的关键问题拟解决的关键问题 1、 为 了 褪 黑 激 素 、 雌 激 素 对 A 生 成 、 沉 积 到 老 年 斑 形 成 ， 拮 抗 自 由 基 从而说明褪黑激素、雌激素是否有时效性干预 AD 病理进 程。 2、 到目前为
4、止仍没有一中老年性痴呆模型能较全面模拟老年性痴呆病理变化和临床 表现。PDAPP 转基因鼠主要特征为脑内 及其伴随的神经元损 害这一 AD 病理机制及行为学表现，能更好地反映 DSS 治疗 AD 的作用。 本项目的特色与创新之处本项目的特色与创新之处 本课题围绕 A生成、 沉积到老年斑形成这一 AD 病理机制主线， 自由基过氧化损害可 加速 A聚集及神经元调亡的要点，选用褪黑激素和雌激素，研究干扰 A的沉积，老年斑 形成，神经元调亡，简明 能不同，研究激素时效性干扰 AD 病理过程 的研究国内外未见有关的报导。 实验方案和技术实验方案和技术 （1）AD 动物模型筛选 PDAPP 转基因鼠筛选
5、选用 PDAPP 转基因鼠的子代鼠，剪鼠尾剪碎匀浆，用 PCR 技术筛选出含存 Happ695 双 突变基因的小鼠用于实验。 SAM-P8 鼠筛选 直接选用 SAM-P8 鼠子代用于实验。 （2）实验分组 实验又分为褪黑激素组（MT 组） 、雌激素组（ET 组） 、联合组和对照组 4 个组，各组 30 只动物。 MT 组：皮下注射 MT 1mg/kg(时间： 10:00pm)，30 只动物。 ET 组：颈部皮下植入可持续释放 60 天的含 1.7mg 雌二醇（ET） ，60 天后再植入一 个，30 只动物。 联合组：皮下注射 MT 1mg/kg(时间： 10:00pm)和颈部皮下植入可持续释放
6、 60 天的 含 1.7mg 雌二醇（ET）60 天后再植入一个，30 只动物。 对照组：分为 MT 组、ET 组、联合组的对照组，各小组 10 只动物，MT 组的对照 组皮下注射生理盐水，ET 组的对照组植入含等量胆固醇的安慰剂，联合组的对照 组注入生理盐水和含等量胆固醇的安慰剂。其他处理方法同各实验组。 （3）激素治疗时间 A、MT 组、ET 组分别在动物 1 月龄、4 月龄、8 月龄时用激素进行治疗，分别治疗 4 个月。 B、联合组分三个时间组合分别注射褪黑激素和雌激素，第一组合为褪黑激素和雌激素 分别在 1 月龄、4 月龄时注射，第二组合分别 4 月龄、8 月龄时注射，第三组合在 8
7、月龄时 注射。用药 4 个月。 C、对照组不进行激素治疗。 所有动物饲养到 12 个月龄时进行一下处理 （4）SAM-P8 鼠和 PDAPP 转基因鼠认知能力测定 所有动物饲养到 12 个月龄时用 Morris 水迷宫测定。 指标：空间探索试验平均逃避潜伏期。 定位航行试验平台象限游泳距离百分比和穿环次数。 （5）PDAPP 转基因鼠脑内 APPmRNA、APP、A检测 小鼠处死立即取出大脑组织，均浆后进行一下测定 APPmRNA 测定：取大脑均将组织用荧光定量 RT-PCR 方法检测各组 APPmRNA 含量。 APP 测定：取大脑匀浆组织用 Wester 印迹法检测各组 APP 含量。 可
8、溶性 A测定：用大脑匀浆组织离心后去上清液，用 ELISA 法检测各组可溶性 A1-40和A1-42含量。 （6）SAM-P8 鼠和 PDAPP 转基因鼠脑内淀粉样颗粒检测 常规光镜固定、取材，取出的大脑组织，各组织作冠状冰冻连续切片，用 Gomori 六胺 银法（Grocott 改良法）染色和免疫组化染色，在光镜下观察前额皮质、海马、内侧隔核、 斜角带核的 A沉积，图像分析系统定量分析 A数量。 （7）PDAPP 转基因鼠老年斑的分析 常规电镜固定、取材、切片和染色，电镜下观察前额皮质、海马、内侧隔核、斜角带 核的老年斑数量和形态结构。 （8）PDAPP 转基因鼠自由基损害分析 小鼠处死立即
9、取出前额皮质、海马、基底前脑，匀浆后去上清液，进行以下测定。 自由基测定：将样品注入平板玻璃管中，用BrukerRCS106 电子顺磁共振仪（EPR）检 测自由基，用相对强度表示，RI=峰值（波宽）2 SOD、MDA 的含量测定：硫代巴比妥酸法测定 MDA 的含量；Xan-Xan 氧化酶系统法 测定 SOD 活性。 （9）SAM-P8 鼠大脑组织形态学观察 常规光镜固定、取材，取出的大脑组织，各组织作冠状冰冻连续切片，切片逢 6 取 3， 随机取相邻的切片分为 3 套，分别作 ChAT 免疫组化染色、AchE 组织化学和尼氏染色。在 光镜下观察前额皮质、海马、基底前脑，图像分析系统定量分析。
10、观察指标： 前额皮质、海马 CA1 区、齿状回神经元数量。 内侧隔核、斜角带垂直支胆碱能神经元数量。 前额皮质、海马 CA1 区、齿状回胆碱能神经纤维数量。 预期结果预期结果 （1） 预期证实褪黑激素、雌激素联合用药比单一用药有更强的抑制 A沉积、老年 斑形成，拮抗自由基损害。也可能得到褪黑激素、雌激素可分解已形成的老年 斑作用。 （2） 预期研究结果能表明褪黑激素、雌激素治疗 AD 作用是否时效性作用有关。为 褪黑激素、雌激素治疗老年性痴呆奠定理论基础。 研究成果将以论文的形式发表在国内外的杂志（68 篇） 。 可行性分析可行性分析 （1） 本课题组自 1987 年开始闹衰老及老年性痴呆的方
11、面的研究， 已获本研究方 向国家自然基金资助 4 项，并有多篇文章发表，其中，申请者 2001 年当 归芍药散抗衰老作用的松果体机制探讨获国家自然科学基金资助，现已 完成。2004 年当归芍药散对淀粉样蛋白生成、沉积到老年斑形成过程 中的多位点抑制机制 再次获国家自然科学基金资助， 研究工作进展顺利， 上述课题研究工作与本次申请的课题从技术方法和研究方向均密切相关， 为完成本课题打下良好基础。 （2） 本课题所用的大部分方法和技术包括六胺银染色、电镜技术、PCR 技术、 A纤维荧光检测、Morris 水迷宫行为测试等本课题在以前研究中已用到， 并有文章发表。 （3） 我们在学校实验动物中心帮助
12、下已成功引进 PDAPP 转基因鼠。一向北京 大学实验动物中心订购一批 SAM-P8 鼠，保证了本研究的动物来源。 （4） 本课题组大部分成员有博士、硕士学位，较年轻，均从事老年医学研究多 年，学校中心实验室为完成本课题提供良好的设备和实验条件，因此完成 此课题在技术方法、人员安排、实验条件上是可行的。 参考文献参考文献 （1）Schenk-D; Barbour-R; Dunn-W.Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer disease like pathology in the PDAAP mouse. Nature, 1999; 400(6740): 173-7 （2）
