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1、 王彦忠王彦忠王彦忠王彦忠186222321571862223215718622232157186222321572013201320132013年年年年3 3 3 3月月月月27272727日日日日- - - -苏州苏州苏州苏州主办单位：中国食品药品监管信息网主办单位：中国食品药品监管信息网主办单位：中国食品药品监管信息网主办单位：中国食品药品监管信息网1. 法规对分析方法验证的要求；2. 验证的方法和接受标准；3. 分析方法的再验证；4. 分析方法的确认；5. 常用法规的查询路径。内容介绍：内容介绍：一、法规对分析方法验证的要求第七章第七章第七章第七章 确认与验证确认与验证确认与验证确认与
2、验证 第一百三十九条：企业的厂房、设施、设备和检验仪器应经过确认和验证，应采用经过验证的生产工艺、操作规程和检验方法进行生产、操作和检验，并保持持续的验证状态。第一百四十二条：当影响产品质量的主要因素，如原辅料、与药品直接接触的包装材料、生产设备、生产环境（或厂房）、生产工艺、检验方法等，发生变更时，应进行确认或验证。必要时，还应经药品监督管理部门批准。10101010版版GMPGMPGMPGMP：第十章第十章第十章第十章 质量控制与质量保证质量控制与质量保证质量控制与质量保证质量控制与质量保证 第二百二十三条：物料和不同生产阶段产品的检验应至少符合以下要求：（二）、 符合下列情形之一的，应对
3、检验方法进行验证：采用新的检验方法；检验方法需变更的；采用中华人民共和国药典未收载的检验方法； 法规规定的其它需要验证的检验方法。10101010版版GMPGMPGMPGMP：（三）、对不需要进行验证的检验方法，企业应对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠。10101010版版GMPGMPGMPGMP：12.82 应在分析仪器/设备完成确认后，再着手分析方法的验证。12.83 对已验证分析方法的任何修改均应有完整的记录，这类记录应包括修改的理由和充分的数据，以证实经修改的方法与规定的方法同样准确、可靠。 ICH Q2(R1): Validation of analytical proce
4、dures: Text and Methodology; ICH Q2A: Text on Validation of analytical procedures (parent guideline); ICH Q2B: Validation of analytical procedures: Methodology (Developed to complement the parent guideline); USP Validation of compendia methods.附录XIX A 药品质量标准分析方法验证指导原则中只规定了验证项目和基本方法，没有合格标准。相对于在分析方法验证
5、中强调分析方法的耐用性（Robustness），ICH更强调在开发阶段确定分析方法的耐用性。二、二、验证方法和接受标准药品的生产过程中，原料、中间品、成品均需进行检验，检验结果既是过程受控的依据，也是评价产品质量的重要依据，检验结果应具有准确可靠。而分析方法的验证为检验结果的准确及可靠提供了有力保障。 分析方法验证系指确保某项分析方法得出的结果可以持续地准确反映所测产品特性的书面证明。通常分析方法的验证可分为药典或注册分析方法的确认和非药典或注册分析方法的验证。 仪器：仪器已经过验证和校正且在有效期内； 人员：人员应经过充分培训，熟悉方法及所使用的仪器； 物料：所用的物料，包括标准品、试剂、实
6、验用容器等，均应符合试验要求，不能带入污染、误差。如进行高效液相色谱分析时，所用试剂应为色谱级；检查铁盐时使用的盐酸不得含有铁盐等； 方法：该分析方法的开发和优化已经成功完成； 环境：试验环境符合该分析方法的要求，例如：有些分析方法可能对温湿度敏感。原则上每个检测项目采用的分析方法，均需要进行方法验证。 方法验证的内容应根据检测项目的要求，结合所采用分析方法的特点确定。 同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。例如，采用高效液相色谱法用于制剂的鉴别和杂质定量试验应进行不同要求的方法验证，前者重点要求验证专属性，而后者重点要求验证专属性、准确度、定量限等验证项目。 （一）需要验证的检测
7、项目 检测项目是为控制药品质量，保证安全有效而设定的测试项目。根据检测项目的设定目的和验证内容的不同要求，通常将需验证的检测项目分为鉴别、杂质检查（限度试验、定量试验）、定量测定（含量测定、溶出度、释放度等）、其他特定检测项目等四类。 （二）分析方法 分析方法是为完成上述各检测项目而设定和建立的测试方法，一般包括分析方法原理、仪器及仪器参数、试剂、系统适用性试验、供试品溶液制备、对照品溶液制备、测定、计算及测试结果的报告等。 （三）验证内容 验证内容通常包括方法的专属性、线性、范围、准确度、精密度、检测限、定量限和耐用性。 专属性 线性 范围 准确度 精密度（重复性、中间精密度和重现性） 检测
8、限（LOD ）和定量限（LOQ） 耐用性不同的分析方法对验证项目的要求：不同的分析方法对验证项目的要求：不同的分析方法对验证项目的要求：不同的分析方法对验证项目的要求：验证项目验证项目鉴别鉴别杂质定杂质定性性杂质定量测杂质定量测定定含量及溶出度等含量及溶出度等准确度准确度-+精密度精密度- - - -重复性重复性-+精密度精密度中间精密中间精密度度-+专属性专属性+检测限检测限-+-定量限定量限-+-线性线性-+范围范围-+耐用性耐用性+专属性系指在其他成分（如杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能够正确鉴定、检出被分析物质的特性。 通常，鉴别、杂质检查、含量测定方法中均应考察其专
9、属性。如采用的方法不够专属，应采用多个方法予以补充。 专属性：专属性：专属性：专属性：1、鉴别反应 鉴别试验应确证被分析物符合其特征。专属性试验要求证明能与可能共存的物质或结构相似化合物区分，需确证含被分析物的供试品呈正反应，而不含被测成分的阴性对照呈负反应，结构相似或组分中的有关化合物也应呈负反应。 专属性：专属性：专属性：专属性：2、杂质检查 作为纯度检查，所采用的分析方法应确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、有机溶剂等。因此杂质检查要求分析方法有一定的专属性。 在杂质可获得的情况下，可向供试品中加入一定量的杂质，证明杂质与共存物质能得到分离和检出，并具适当的准确度与精密度
10、。 专属性：专属性：专属性：专属性：2、杂质检查 在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过与另一种已证明合理但分离或检测原理不同、或具较强分辨能力的方法进行结果比较来确定。或将供试品用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化的方法进行破坏（制剂应考虑辅料的影响），比较破坏前后检出的杂质个数和量。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测，进行色谱峰纯度检查。 专属性：专属性：专属性：专属性：3、含量测定 含量测定目的是得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果。 在杂质可获得的情况下，对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质和辅料的供试品比较测定结果。
11、在杂质或降解产物不能获得的情况下，可采用另一个经验证了的或药典方法进行比较，对比两种方法测定的结果。也可采用破坏性试验（强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化），得到含有杂质或降解产物的试样，用两种方法进行含量测定，比较测定结果。必要时进行色谱峰纯度检查，证明含量测定成份的色谱峰中不包含其他成份。 专属性：专属性：专属性：专属性：1. 应当证明潜在的干扰成分不会对方法的性能产生负作用。对于层析分离方法，要求证实杂质之间杂质与主峰之间的选择性；分辨率1.5，如果证明确实可行，某些情况下分辨率低于1.2也可以接受。2. 空白对照应无干扰。1.波长的选择；2.每次试验时必须运行空白样品；3.试剂、玻
12、璃容器、流动相和过滤介质可能会影响方法的专属性。线性系指在设计的测定范围内，检测结果与供试品中被分析物的浓度（量）直接呈线性关系的程度。 线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量检查、含量和溶出方法均需要验证其线性。 可用一贮备液经精密稀释或分别精密称样，制备一系列的供试品进行测定，至少制备5个浓度（通常选取50, 80%, 100%,120%和150）。线性：线性：线性：线性：并且80%, 100%和120%的数据也可以用来确定方法重现性。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。 必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。 线性
13、：线性：线性：线性：线性的接受标准：线性的接受标准：线性的接受标准：线性的接受标准：1.监测器的设计和型号；2.流动相和被分析物的紫外特性；3.色谱峰的完整性。范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。杂质定量检查、含量和溶出方法均应验证其范围，分析方法的范围应根据具体分析方法以及对线性、准确度、精密度的结果和要求确定。无特殊要求时，通常采用以下标准。范围通常用与分析方法测试结果相同的单位（如百分浓度）表达。涉及到定量测定的检测项目均需要对范围进行验证，如含量测定、含量均匀度、溶出度或释放度、杂质定量试验等。 范围：范围：范围：范围： 对于半成品或者成品含量测
14、试，范围通常为测试浓度的80%-120%； 对于杂质测试，范围为测试浓度的50%-120%； 对于含量均匀度测试，除了基于剂型本身特点（例如：计量剂型气雾剂、喷雾剂）而确定的更宽的范围外，范围应为测试浓度的70130；范围的接受标准：范围的接受标准：范围的接受标准：范围的接受标准： 对于溶出度测试，范围应为标准规定范围的土20。如某一剂型的溶出度规定，1h 后溶出度不得小于20，24h 后溶出度不得小于90，则考察此剂型的溶出度范围应为0110%。例如：某缓释制剂规定，1小时释放不得小于20%，8小时释放不得小于80%，那么验证范围应当为标示量的0-100%。 范围的接受标准：范围的接受标准：
15、范围的接受标准：范围的接受标准：准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率%表示。准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证其准确度，如杂质定量检查、含量和溶出方法，分析方法的准确度能够确保： 样品中的待测物全部溶解； 待测物全部从检测器中检出。准确度：准确度：准确度：准确度：准确度的测定至少选取包括标准浓度在内的至少3个浓度级别（通常选取80、100和120），每个浓度级别至少测定3次，计算测定结果的回收率。 原料药1. 可用已知纯度的对照品或符合要求的原料药进行测定； 2. 用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。准确度：
16、准确度：准确度：准确度：制剂1. 用含已知量被测物的各组分混合物进行测定；2. 如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定（加样回收试验法）；3. 用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。 杂质 1. 往样品中加入已知量的杂质进行测定；2. 若不可能得到某种杂质或降解产物，可把此方法的分析结果与另一已验证的或药典的分析方法获得的结果进行比较。 准确度：准确度：准确度：准确度：通常采用回收率测定的试验可分为： 空白回收（制剂空白） 加样回收（适用于：中药材，复方制剂等）空白回收的计算方法：准确度：准确度：准确度：准确度：加样回收的计算方法：其中： M为测定值
17、； P为背景值；A 为已知值（真实值）。准确度：准确度：准确度：准确度：加样回收的试验方法： 同一样品，制备三个浓度的供试品，每个浓度分别制备三份供试液，例如： 取相同量样品9份（一般为样品取样量的一半），设计三个浓度，按不同比例加入对照品。中间浓度一般按1:1比例加入；低浓度和高浓度可分别选0.5:1和1.5:1的比例，加入对照品的量要适当，保证供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内。准确度：准确度：准确度：准确度：含量和溶出：HPLCHPLCHPLCHPLC方法的接受标准方法的接受标准方法的接受标准方法的接受标准各浓度下的平均回收率应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对
18、标准差（RSD）应不大于2.0%。中药一般应满足以下规定：回收率计算值在95%-105%范围，相对标准偏差（RSD%）薄层扫描法5%。含量和溶出：UVUVUVUV方法的接受标准方法的接受标准方法的接受标准方法的接受标准各浓度下的平均回收率应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于1.0%。容量分析方法的接受标准容量分析方法的接受标准容量分析方法的接受标准容量分析方法的接受标准各浓度下的平均回收率应在99.7%-100.3%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于0.2%。杂质：1.活性物质；2.容器或过滤器可能会吸附活性物质；3.处方中的辅料、色料
19、和制造过程可能会影响准确度。4.待分析物质是否完全溶解以及溶液的澄清度。精密度系指在规定的条件下，从同一个均匀样品中，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差（d）、标准偏差（SD）、相对标准偏差（RSD）（变异系数CV）表示。 偏差（d）d=xi-x 测量值与平均值之差； 标准偏差（SD） SD 相对标准偏差（RSD） RSD112)(=ninixx%100xSD杂质定量检查、含量和溶出方法均应验证其精密度，精密度可以用重复性、中间精密度和重现性表示。1、重复性 重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的接近程度。重复性的评价：(1) 在方法规定的线
20、性范围内至少测定9 次(如3 个浓度级别80，100和120，每个浓度级别测定3 次)，或(2) 在100的试验浓度，至少测定6 次。注意：每种测定应从样品称量或者高浓度溶液的稀释开始。 2. 中间精密度：系指同一实验室不同日期、不同仪器、不同分析人员对同一样品、采用同一方法处理样品所得结果之间的接近程度。验证方法：同一批样品每位分析员准备六份进行测量，计算两人之间平均值的差异。 3. 重现性：一般实验室不进行此项考察，只有当分析方法将被法定标准采用时，才进行重现性试验。建立药典分析方法时常需通过协同检查得出重现性的结果。1.重复性原料药方法验证时，API的RSD1.0%；制剂方法验证时，活性
21、成份的RSD2.0%；杂质方法验证时，每个杂质的RSD20%。2.中间精密度原料药方法验证时，平行六份样品的RSD 1.0 %，两人之间的平均值之差1.0 %。 制剂方法验证时，平行六份样品的RSD2.0 %，两人之间的平均值之差3.0 %。 杂质方法验证时，平行六份样品的RSD 20.0 %，两人之间的平均值之差如下：以下因素可能会影响到分析方法的精密度：1.仪器的设计和设置；2.样品的均一性；3.化验员的分析技术、所采用的试剂和环境；4.色谱峰的形状和分离度；5.分析方法的耐受性、回收率、波长的选择。检测限系指在确定的试验条件下，试样中被测物能被检测出的最小量；定量限系指在确定的试验条件下
22、，试样中被测物能被准确测定的最小量，其测定结果应具有一定准确度和精密度。杂质限度检查时应验证其方法的检测限，杂质定量检查时应验证其方法的定量限。确定某一分析方法检测限和定量限的方法：1. 目视法（直观评价，非仪器分析） 可用于非仪器的分析方法，也可用于仪器的分析方法，用已知浓度的被测物，试验出能被可靠的检测出的最低浓度或量；对于定量限需要有一定的准确度和精密度。2.信噪比该方法适用于出现基线噪音的分析方法。信噪比的测定是通过比较含已知低浓度被分析物的样品与空白样品的测试信号，确定被分析物可被确切地检测的最小浓度，典型的信噪比为3:1；对于定量限典型的信噪比为10:1。耐用性系指测定条件发生小的
23、变动时，测定结果不受影响的承受程度。耐用性主要考察方法本身对于可变试验因素的抗干扰能力。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则建议在方法中予以写明。 典型的变动因素包括：液相色谱法中流动相的组成、流速和pH值、不同厂家或不同批号的同类型色谱柱、柱温等。气相色谱法中载气及流速、不同厂家或批号的色谱柱、固定相、载体、柱温、进样口和检测器温度等。 在评估参数时需要获得改变条件后与标准条件下的测量结果，通过对改变条件后与标准条件下结果的比较来评估方法的耐用性。改变条件后与标准条件下结果的差异计算公式如下: %Difference=100-100Rm/ Rs 其中： Rm 改变条
24、件后的含量结果； Rs 标准条件获得的含量结果。 1.原料药和制剂： 主要成分的含量差异不得大于1.5%。 2.杂质：三、分析方法的再验证三、分析方法的再验证 在某些情况下，如原料药合成工艺改变、制剂处方改变、分析方法发生部分改变等，均有必要对分析方法再次进行全面或部分验证，以保证分析方法可靠，这一过程称为方法再验证。 再验证原则：根据改变的程度进行相应的再验证。 当原料药合成工艺发生改变时，可能引入新的杂质，杂质检查方法和含量测定方法的专属性就需要再进行验证，以证明有关物质检查方法能够检测新引入的杂质，且新引入的杂质对主成份的含量测定应无干扰。 当制剂的处方组成改变、辅料变更时，可能会影响鉴
25、别的专属性、溶出度和含量测定的准确度，因此需要对鉴别、含量测定方法进行再验证。 当原料药产地来源发生变更时，可能会影响杂质检查和含量测定的专属性和准确度，因此需要对杂质检查方法和含量测定方法进行再验证。 当质量标准中某一项目分析方法发生部分改变时，如采用高效液相色谱法测定含量时，检测波长发生改变，则需要重新进行检测限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证，证明修订后分析方法的合理性、可行性。 方法再验证是对分析方法的完善过程，应根据实际改变情况进行再验证，从而保证所采用的分析方法能够控制药品的内在质量。 四、分析方法的确认四、分析方法的确认 药典或注册方法通常不需要验证，但是需要通过方法确
26、认来证明方法在实际应用条件下的适应性。 除了一些特殊的分析方法外，实验室日常测试操作步骤通常不需要确认，例如：干燥失重、炽灼残渣、酸值和简单的仪器方法。 尽管不需要对分析方法重新验证来确认其在实际应用环境中的适用性，但是建议对下列分析方法的一些特征参数进行确认： USP第一类方法系指药品的主要成分或者成品药物的活性成分（包括防腐剂）的定量分析，此类方法需要评估专属性和精密度； USP第二类方法系指确定多数药品杂质或者成品药物的降解化合物的分析，此类方法需要评估精密度、专属性与定量限。 USP第三类方法系指确定特征性能的分析步骤（如溶出、药品释放），此类方法需要评估专属性与精密度。 USP第四类
27、方法系指鉴别检测，此类方法需要评估专属性。五、常用法规查询地址五、常用法规查询地址ICH: http:/www.ich.org/ Q2A: Text on Validation of Analytical Procedures Q2B: Validation of Analytical procedures: MethodologyEU: http:/www.emea.eu.int/htms/human/ich/quality/ichfin.htm CPMP/ICH/381/95 (ICH Q2A: adopted Nov 94 at step 5) CPMP/ICH/281/95 (ICH
28、Q2B: adopted Dec 96 at step 4)FDA: http:/www.fda.gov/cder/guidance/guidance.htm Guideline for Industry: Validation of Analytical procedures: Methodology (Federal Register, May 97, 62 FR 27464) Guideline for Industry: Text on Validation of Analytical Procedures (Federal Register, Mar 95, 60 FR 11260)
29、 Draft Guidance for Industry: Analytical Procedures and Methods Validation (Aug 2000)USP: Validation of Compendial Procedures standard applied to monograph methods harmonised with ICH Q2A and Q2B (but not identical)BP 2005: Supplementary Chapter III D. Monograph Development: Methods of Analysis concerns methods described in the BP does not detail validation requirements refers to ICH and WHOJP XIV: General Information Chapter 16 Validation of Analytical Procedures does not cross reference ICH (some similarity, some differences)WHO: Technical Report Series 823, Annex 5, 1992Q&A? 谢 谢
