《实验性肝癌中比较槐耳与il对pten和ilr阳性细胞的影响;》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验性肝癌中比较槐耳与il对pten和ilr阳性细胞的影响;（61页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验性肝癌中比较槐耳与实验性肝癌中比较槐耳与IL-2IL-2对对 PTENPTEN和和IL-2RIL-2R阳性细胞的影响阳性细胞的影响 研究生研究生 陆鹏陆鹏 指导教师指导教师 陈莉教授陈莉教授 前言前言 肝癌肝癌是我国第三位恶性肿瘤，约占全世是我国第三位恶性肿瘤，约占全世 界肝癌病例的界肝癌病例的42.5%42.5%。该病病程短、进展快、。该病病程短、进展快、 病死率高，严重危害着我国人民的健康和生病死率高，严重危害着我国人民的健康和生 命。命。 槐耳清膏槐耳清膏是一种入药是一种入药15001500年但湮没已年但湮没已 300300余年的重要药用菌，作为一种治疗肝癌余年的重要药用菌，作为一种
2、治疗肝癌 的药用菌，在民间早已有应用。槐耳清膏标的药用菌，在民间早已有应用。槐耳清膏标 本经鉴定学名为本经鉴定学名为Trametes Trametes Robiniophila Robiniophila MurrMurr. .，中文名为槐栓菌。中文名为槐栓菌。 PTENPTEN ( (与细胞骨架蛋白与细胞骨架蛋白tensintensin同源在肿同源在肿 瘤的瘤的1010号染色体有缺失的磷酸酯酶号染色体有缺失的磷酸酯酶) )是定位于是定位于 1010q23q23的一种具有磷酸酯酶活性的抑癌基因的一种具有磷酸酯酶活性的抑癌基因 ，PTENPTEN蛋白能够抑制肿瘤的浸润和转移，诱蛋白能够抑制肿瘤的浸
3、润和转移，诱 导细胞凋亡和阻滞细胞周期。导细胞凋亡和阻滞细胞周期。 IL-2IL-2被称为被称为T T细胞生长因子。细胞生长因子。IL-2IL-2主要以主要以 自分泌或旁分泌的方式，诱导特异性自分泌或旁分泌的方式，诱导特异性CTLCTL克克 隆增殖，杀伤肿瘤细胞。隆增殖，杀伤肿瘤细胞。 本课题拟通过诱癌剂诱导大鼠肝癌，并 通过应用槐耳清膏和IL-2干预癌形成过程，诱 癌20周后观察肝组织的病理变化、IL-2R阳性细 胞的表达情况以及PTEN表达水平，从而探讨与 比较槐耳与IL-2对于肝癌形成与发展的影响， 及其可能的作用机制。 材料与方法材料与方法 1 研究对象 2 主要试剂 3 方法 404
4、0只雄性只雄性SDSD大鼠（本校实验动物中心大鼠（本校实验动物中心 ） 动物实验试剂动物实验试剂 二乙基亚硝胺（二乙基亚硝胺（DENADENA，SigmaSigma公司公司 ）、金克）、金克- -槐耳清膏（江苏启东盖天力药业槐耳清膏（江苏启东盖天力药业 有限公司）、注射用重组人有限公司）、注射用重组人IL-2IL-2（江苏金丝江苏金丝 利药业有限公司）。利药业有限公司）。 免疫组化试剂 IL-2R/ CD25链单克隆抗体（NeoMarkers 公司）、 即用型免疫组化二步法染色试剂盒 （福州迈新 KIT-9801）。 RT-PCRRT-PCR试剂试剂 RT RT试剂盒（上海生工生物技术服务有限
5、公司）试剂盒（上海生工生物技术服务有限公司） PCR PCR试剂盒（上海生工生物技术服务有限公司）试剂盒（上海生工生物技术服务有限公司） 100 100bpbp DNA ladder DNA ladder（华美生物工程公司）华美生物工程公司） PTEN PTEN引物（上海生工生物技术服务有限公司）引物（上海生工生物技术服务有限公司） 内参内参GAPDHGAPDH引物（上海生工生物技术服务有限引物（上海生工生物技术服务有限 公司）公司） 1) 动物实验 2) 常规切片制作 3) HE染色及镜下观察 4) 免疫组织化学染色检测IL-2R阳性细胞 5) RT-PCR检测PTEN表达 6) 统计分析
6、4040只正常雄性只正常雄性SDSD大鼠，体重大鼠，体重100120100120g g。大大 鼠置普通级动物实验室饲养，标准饲料喂养鼠置普通级动物实验室饲养，标准饲料喂养 及自由饮水，气温及自由饮水，气温20202525，湿度为，湿度为50-60%50-60% ，2-32-3只只/ /笼笼 实验分组实验分组 正常对照组 (G1) 单纯诱癌组 (G2) 诱癌加槐耳清膏组 (G3) 诱癌九周后槐耳清膏组 (G4) 诱癌九周后IL-2组 (G5) 生理盐水生理盐水 DENADENA DENA+DENA+九周后槐耳清膏九周后槐耳清膏 DENA+DENA+九周后九周后IL-2IL-2 DENA+DENA
7、+槐耳清膏槐耳清膏 DENADENA灌胃，灌胃，7070mg/kgmg/kg，每周一次，连续用每周一次，连续用 药药1515周后停药周后停药 免疫组化二步法 抗原修复：柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）煮沸 20min IL-2R 链单克隆抗体（工作浓度：1400） 37孵育30min，4过夜 捷达形态分析系统计数IL-2R阳性细胞数 PCRPCR执行程序：执行程序： 9494，2 2min94min94，4040秒（变性）秒（变性） 3232次次 5656，4040s72s72，40s7240s72，5min45min4 （复性）复性） （延伸）（延伸） （总延伸）（总延伸） 第第1010个循环结
8、束后（停留在个循环结束后（停留在7272，提前，提前1010秒秒 ）暂停）暂停，PCRPCR反应体系中加入内参反应体系中加入内参GAPDHGAPDH引引 物物2.02.0ll后同管扩增。后同管扩增。 PCRPCR产物产物1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 四星凝胶图像分析系统四星凝胶图像分析系统测定条带密度测定条带密度 PTENPTEN的相对表达量的相对表达量=( =( L L P P - L- L B B )/(L )/(LG G -L -L B B) ) L LP P PTEN PTEN条带密度条带密度 L L GG GAPDH GAPDH条带密度条带密度 L LB B 背景密度背景密度
9、 StataStata 6.0 6.0统计软件统计软件 多组等级资料多组等级资料 秩和检验秩和检验（KruskalKruskal-Wallis-Wallis法法 ） 率的比较率的比较 卡方检验卡方检验 两样本均数的比较两样本均数的比较 t t检验检验 多个样本均数的比较多个样本均数的比较 单因素方差分析单因素方差分析 两变量依存关系两变量依存关系 直线相关分析直线相关分析 检验水准检验水准 0.050.05 结果结果 1 病理观察 2 免疫组化结果观察 3 RT-PCR检测PTEN表达 4 比较IL-2R阳性细胞数与PTEN相对表达量 的关系 1) 1) 各组大鼠肝脏病理观察各组大鼠肝脏病理观
10、察 2) 2) 各组鼠肝组织正常、不典型增生与癌形成各组鼠肝组织正常、不典型增生与癌形成 的比较的比较 3) 3) 各组癌形成率的比较各组癌形成率的比较 正常对照组，正常对照组，HEHE染色染色250250 单纯诱癌组，癌形成伴有明显坏死单纯诱癌组，癌形成伴有明显坏死 HEHE染色染色250 250 诱癌加槐耳清膏组，不典型增生结节诱癌加槐耳清膏组，不典型增生结节 HEHE染色染色250 250 诱癌加九周后槐耳清膏组诱癌加九周后槐耳清膏组 卵圆细胞增生卵圆细胞增生 HEHE染色染色250250 诱癌加九周后诱癌加九周后IL-2IL-2组组 以透明细胞为主的增生伴以透明细胞为主的增生伴 癌结节
11、形成癌结节形成 HE HE染色染色250250 各组中组织切片正常、不典型增生与癌形成各组中组织切片正常、不典型增生与癌形成 的比较的比较 百分率（）百分率（） 组别组别 秩和检验：秩和检验： 2 2 =20.053 =20.053 （p p0.00050.0005 ） 组间比较各组癌形成率（卡方检验组间比较各组癌形成率（卡方检验 ） G 1 2 3 4G 1 2 3 4 -|-|- 2 | 10.370 2 | 10.370 | | 0.0010.001 | | 3 | 1.436 5.333 3 | 1.436 5.333 | 0.231 | 0.231 0.0210.021 | | 4
12、| 2.637 3.899 0.258 4 | 2.637 3.899 0.258 | 0.104 | 0.104 0.0480.048 0.612 0.612 | | 5 | 2.637 3.899 0.258 0.000 5 | 2.637 3.899 0.258 0.000 | 0.104 | 0.104 0.0480.048 0.612 1.000 0.612 1.000 1) IL-2R阳性细胞的特征与分布 2) 各组大鼠肝脏中IL-2R阳性细胞数的比较 3) 诱癌各组无癌形成病例与癌形成病例中IL -2R阳性细胞数的比较 单纯诱癌组单纯诱癌组 肝癌中肝癌中IL-2RIL-2R阳性表
13、达于淋巴细胞膜阳性表达于淋巴细胞膜 及胞浆及胞浆 免疫组化二步法免疫组化二步法500500 诱癌加槐耳清膏组诱癌加槐耳清膏组 肝组织中肝组织中IL-2RIL-2R阳性表达于阳性表达于 淋巴细胞膜及胞浆淋巴细胞膜及胞浆 免疫组化二步法免疫组化二步法500500 F F17.5717.57，（，（p p0.000.00） 组别组别 IL-2RIL-2R阳性细胞数阳性细胞数 各组大鼠肝脏中各组大鼠肝脏中IL-2RIL-2R阳性细胞数的比较阳性细胞数的比较 （单因素方差分析）（单因素方差分析） G 1 2 3 4G 1 2 3 4 -|-|- 2| 0.975 2| 0.975 | 1.000 | 1.000 | | 3| 20.308 19.333 3| 20.308 19.333 | | 0.020 0.0480.020 0.048 | | 4| 19.761 18.786 -0.548 4| 19.761 18.786 -0.548 | | 0.018 0.0450.018 0.045 1.000 1.000 | | 5| 38.646 37.671 18.338 18.886
