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1、南京师范大学 硕士学位论文 微生物代谢烟碱类杀虫剂啶虫脒和噻虫啉的研究 姓名：姬微微 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：戴亦军 20100529 中文摘要 中文摘要 微生物代谢烟碱类杀虫剂啶虫脒和噻虫啉的研究 本文研究了微生物对烟碱类杀虫剂啶虫脒( A A P ) 和噻虫啉( T H I ) 的代谢和降 解作用，分析了杀虫剂的分子结构与微生物代谢之间的关系，并结合土壤微生物对烟 碱类杀虫剂的降解半衰期和代谢产物的生物活性，探讨了烟碱类杀虫剂的分子结构 代谢代谢产物生物活性施用方式之间的关系。 1 本实验室前期研究发现粘质红酵母鼢D 如幻，“肠朋“c f 缸g f ，z D s 口2
2、 可降解 丸垤，本文进一步研究了兄聊“c f 儿培f ，z D s 口I M 2 对灿心、1 】m 、吡虫啉( 咀) 和氯噻 啉( I M T ) 的代谢及代谢途径。足所”c f f I z ，l 口n 2 在含蔗糖的矿物培养基中可降解 含氰基亚胺基药效基团的丸廿和T ，降解半衰期分别为3 4 和1 4 2 天；足 研“c f 死硒甩D s 口讧2 不降解含硝基亚胺基药效基团的和I M T 。转化产物经H P L C M S 和核磁共振( N M R ) 光谱分析显示，兄m “c 玎a ：挖口订2 可氧化断裂A A P 的氰基亚 胺基生成中间产物M1 3 ；水合T H I 的氰基生成酰胺噻虫啉
3、( T H I 锄i d e ) 。细胞色素 P 4 5 0 酶抑制剂胡椒基丁醚( P B O ) 和黄素单加氧酶抑制剂甲硫咪唑不抑制尼 所“c 蝴伽蹦- 2 对A A P 和唧的降解和产物形成，表明单加氧酶系没有参与丸廿 和T m 的降解及产物的生成。 I M1 3 和T H I 卸：l i d e 对蚕豆蚜生物活性的测试表明，1 3 没有杀虫活性；n 缸 锄1 i d e 有相当的内吸和触杀活性，但其触杀活性比叨降低了3 8 6 倍，内吸活性比 唧降低了1 5 6 倍。R 聊“c f 缸刀口I M 2 菌株代谢钆心生成1 3 是一种生物活性 丧失的过程，转化T m 生成砌a l i d e
4、 则是一个降低生物活性的过程。 兄棚甜c f 缸以D s 口D 讧2 在灭菌土壤中显示了一定的降解A A P 和唧的能力，3 0d 实验组的A A P 减少4 0 0 ，对照组的丸址减少了1 4 5 ( p 量 o o 图2 1 1 足朋凇f 啦却口订一2 对虬廿、n 丑、和I M T 的降解曲线 在如材料和方法中所述的转化条件下，未接种足研叼甜铅忉傩口v I - 2 的底物对照组不降解蚣P 和 T H I ，因而可排除u 心和T H I 的自发降解。A ，B ，C 和D 分别表示足m 馏f 幻舒加s aI M - 2 降解础心，T H I ， m 和I M T 。 测定O D 6 0 0 值
5、结果显示，在蔗糖M S M 培养基中，添加2 0 0 m g L 的T 和m 仃 对细胞的生长有明显的抑制作用。添加5 0 0m g L 的M I 和A A P 对细胞生长的抑制作 1 0 第二章粘质红酵母鼢D 如f c 矿“肠m 们f 蛔乡加o s 口I M - 2 代谢钆蟑，T H I ，I M I 和I M T 的研究 2 0 0 9 ；D 2 L ie ta 1 2 0 1 0 ) 。P B O 和黄素单加氧酶抑制剂M I 对见聊“c f 姆，z o s 口I M 一2 降解 A A P 和T m 和产物生成的影响结果( 图2 1 4 ) 显示，P B 0 和M 不抑制A A P 和
6、砌的降解，也不抑制代谢产物的生成。结果表明足聊“c f 协f 刀o s 日M 一2 代谢丸心和 T H I 的机制与加口鲫忍f ，妇C G M C C1 1 7 8 8 代谢魁心和T m 的机制完全不同。 图2 1 - 4P B O 和M M I 对足m 凇f 蛔珈口垤2 降解A 八P 和聊和产物生成的影响 P B O 和M 先溶解于丙酮中，足m 船f 缸咖D 阳I M - 2 培养1d 后，分别加入终浓度为1 蚴o n ，的 P B O 和M M I 。3d 后取样，进行H P L C 分析。添加P B O 和M M I 实验组和对照组的底物降解和产 物生产之间没有差异( 胗0 0 5 )
7、。 3 讨论 烟碱类杀虫剂在土壤施用方面有很大的不同，丸心限制施用( + ) ，T 不适施 用( ) ，I M I 适合施用( 十卜 ) ，这些不同与他们在土壤中的稳定性有关。姗在北欧 土壤环境下半衰期大于1 0 0 天( A n h a l te ta 1 2 0 0 7 ) ；在各种有氧土壤环境下丸心可 以很快被降解，半衰期为1 8 天，在印度土壤环境下半衰期为1 6 17 天( G u p t a2 0 0 7 ) 。 融o l u l 报道噻虫啉作为杀虫剂施用后会从环境中快速消失，在北欧的土壤条件下噻虫 啉的半衰期为9 2 7 天，南欧土壤条件下为1 0 1 6 天：本实验室最近的实验
8、结果表明， 在相同的土壤条件下，A A P 和T H I 的半衰期小于5 天，然而I M I 和M T 的半衰期超 一零一是；Qm；一m岂 第二章粘质红酵母鼢D 面幻，“f am 们f 口I M 2 代谢虬心，T H I ，I M I 和M T 的研究 过4 0 天。以上结果表明，丸心和T H I 在土壤中很容易被降解。土壤微生物对础心 和T H I 的代谢作用被认为是主要的降解途径。本研究中，尼m “c 她加D 阳蹦- 2 对姗， I M T ，A A P 和T H I 的降解可以看出，在土壤真菌的作用下，杀虫剂的半衰期是不同 的。丸廿和T H I 在土壤真菌纯培养条件下降解半衰期较短，分别
9、为3 4 和1 4 2 天， 而对M I 和I M T 却不能降解，和文献报道的钆让和T m 在土壤中持效期较短，M I 和m 仃在土壤中持效期较长相一致。这也和丸心和T H I 更适用于叶面喷洒，M 和 m 仃适用于土壤施用有密切的关系。A A P 和T m 可以在足聊“c f 地g f ，2 D s 口2 的作用 下转化为两个极性更高的化合物，这两个化合物的分子结构及性质与其母体化合物的 杀虫持效性有密切的联系。所以需要对这两种化合物进行分离提纯，并对其结构进行 鉴定。 农药的代谢通常被认为与细胞色素P 4 5 0 酶系有关，S C b m z J a n d e r ( 2 0 0 2
10、) 报道人肝 细胞微粒体和细胞色素P 4 5 0 酶同工酶可将I M I 代谢为5 h u d r o X yM 。文献报道，P B 0 可抑制聊口加础f 加C G M C C1 1 7 8 8 的m 的羟基化作用和虬廿的脱甲基化，因此 以羟基化和脱甲基化方式代谢杀虫剂与P 4 5 0 酶有关( 杨顺瑛等2 0 0 8 ；C h e nc ta 1 2 0 0 8 ) 。本节中，在M S M 培养基中添加1 m m o 儿的细胞色素P 4 5 0 酶抑制剂胡椒基 丁醚( P B O ) ，对转化的影响结果表明，P B O 对A A P 和T H I 底物的减少和代谢产物 没有影响，因此，细胞色
11、素P 4 5 0 酶系没有参与足m “c f 五q ，z D s 口2 对A A P 和的 代谢作用。 1 4 第二章粘质红酵母融D 如幻删肠m 们f 厶硭珈D s 口I M 2 代谢u 一，T H I ，I M I 和M T 的研究 第二节见m “c 抛伽傩口I M 一2 代谢A A J P 和T 的产物的分离、提 纯和结构鉴定 足m 甜c f f I z 以D s 口I M 2 可将A A P 和T H I 转化为极性更大的产物。本节主要采用5 L 发酵罐进行发酵和转化，提取和提纯产物，并采用质谱，核磁共振等技术对转化产物 进行结构表征，确认转化产物的结构，并进一步说明粘质红酵母的代谢方式
12、及途径。 1 材料和方法 1 - 1 培养基 三P D 培养基、M S M 培养基，其成份见上节，发酵时加入0 1 “r v ) 协S P 5 8 型消泡剂( 淮安塞欧消泡剂厂) 。 丸心和T H I 在M S M 中的浓度分别为5 0 0 m g L 和2 0 0 m g L 。以上培养基均在1 2 1 灭菌3 0m i I l 。 1 2 菌种 足朋“c f 妞，2 D s 口垤- 2 由本实验室分离和保存。 1 3 培养和转化方法 取一8 0 。C 冰箱中保藏菌种，接种于! P D 培养基平板，3 0 。C 培养至出现单菌落， 选取菌落较大的单菌落接种于含3 0 I n L 三P D 培
13、养基的1 0 0 池三角瓶中，3 0 0 C ， 2 2 喊振荡培养2 4 h 。将种子液接种到装液量为3 2 LM S M 培养液的5 L 发酵罐 ( G B C S - 5 B - 1 型发酵罐，E a s tB i o Z h e n 自i 趾g ，C 址1 a ) 。发酵条件为：转速3 0 0 凼血，温 度3 0 0 C ，通气量6I ，m 毗罐压维持在O 1M P a ，定时取样，根据产物的含量稀释相应 倍数，样品待测m ，L C 。转化1 0 1 4d 后，发酵液于B e c k m a I l 超速冷冻离心机5 0 0 0 幽血 离心2 0 曲后，收集上清液备用。 1 4 转化产
14、物提取与纯化 1 4 1A A P 产物的提取：上清液用等体积的乙酸乙酯萃取，在有机相内加适量无 水硫酸钠，去除水份。有机相进行真空浓缩结晶后，等进行制备加? L C 纯化。 1 4 2T H I 产物的提取：发酵液于1 0 0 0 0 印m 离心1 5 曲，发酵液中加入1 1 0 体积 的二氯甲烷以去除未降解的底物，振荡分离后，取水相。水相部分用等体积的乙酸乙 酯萃取，共萃取两次。萃取液进行真空浓缩和结晶。 第二章粘质红酵母鼬D 如幻，“肠肌船矗昭锄口I M 2 代谢A A P ，T H I ，n m 和订T 的研究 1 4 3 产物纯化：将上述样品用流动相重新溶解。制备型H P L C 为
15、A g i l e n t1 2 0 0 肿L C 制备H P L C 仪。色谱柱为E c l i p s eX D B C 1 8c 0 1 眦姐( 2 1 2 1 5 0m m ，7 m ，U S A ) 。 流速2 0m 1 m h 制备丸奸产物的流动相比例为乙腈：水= 3 0 ：7 0 ，T 产物为乙腈： 水= 3 5 ：6 5 。检测器为G 1 3 6 5 BM w D 检测器，丸心和T m 产物的检测波长设为2 3 5 和2 4 2 衄。每次进0 5I n l 。根据制备H P L C 图谱，收集各个组分。每个组份经分析 型H P L C 分析，确认为目的产物后，进行制备瑚? L
16、C 收集。对收集的样品进行浓缩结 晶。晶体加1 0 毫升乙腈重溶，转移至小烧杯中，真空干燥，? L C 分析其纯度。 1 5 丸心和T m 代谢产物的结构分析 1 5 1M S 分析：取少量晶体送环保部南京环境科学研究所进行质谱分析，样品溶 于甲醇中，质谱仪为W a t e r sQ 蜘M i c r o 电离喷雾液质联用仪，离子源为阳离子。 1 5 2 核磁共振光谱分析：取少量产物晶体样品送到本校分析测试中心，采用 B m k e rA V 4 0 0 ( 瑞士产) 进行1 3 C 和1 H 核磁共振光谱分析，溶剂为D M S O d 6 。1 H 和1 3 C 核磁共振光谱工作频率分别为4 0 0 M H z 和1 0 0 M H z 。化
