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1、微囊藻毒素L R 对人羊膜F L 细胞P P 2 A 各驻基转录水平的影响 粱婧徐立红 ( 浙淹太学医学巯生物化学与遗传学臻，铙翔3 1 0 0 5 8 ) 嫡舞；赞囱磷隧2 A ( P r o t c i n p h o s p h a t a s e 2 A ，P P 2 A ) 怒睦乳溺襁体内赣癸麴豁可协鼗国磷羧憋。移萄了悻癌众多 然蟹逶路鄱璧憩避张的谴帮。本文采用爱时定辍P C R 方法磷鬣微黉凝澎豢( m i c a x 圮y s t i n 。M C ) L R 瓣蔗鬻夫羊髅 纲臌F L ( h u M a na m n i o t i cc e l l s ) 的P P 2 A
2、箨驻整谯转潦承平的鼯噙。懿襞烈零，谯1 0 0 、5 0 0 、1 0 0 0 r i MM C L R 作 用2 4 h 聪，C 诬罐m R N A 液这I - 补，A 鹱罐- F 降。谰。餐豫麓B 黎鼷备豫藜楚纯多榉。 夔键溺：蛋翻臻黢酶2 A ；微囊禳毒索；m R N A ；绥时定魁P C R E f f e c t0 fM i C r o c y s t i nL Ro nt h eT r a n s c r i p t i o no fS u b u n i t so fP P 2 A o fH u M a nA m n i o t i cC e l l s L I A N GJ i
3、 n g ，X UL i h o n g ( D e p a r t m e n to fB i o c h e m i s t r ya n dG e n e t i c s ，M e d i c a lS c h o o l ，Z h e j i a n gU n i v e r s i BH a n g z h o u 310 0 5 8 ) A b s t r a c t ：P r o t e i np h o s p h o t a s e2 Ai St h er D & l j o rs e r i n e _ t h r e o n i n ep h o s p h o t a
4、s ei nm a l m n a l i a nc e l l s + w h i c h t a k ep a r ti nr e g u l a t i o no fn u M e r o u ss i g n a l i n gp a t h w a y s 。T h em R N Ae x p r e s s i o no fs u b u n i t so fP P 2 Ao f F Lc e l l se x p o s e dt om i c r o e y s t i nL RW a Sd e t e c t e db yR e a l t i 黼争e 歉，1 飞er e s
5、 u l t ss h o w e dt h a ta f t e rt r e a t e d b V1 0 0 ，5 0 0 。1 0 0 0 n MM C L Rf o r2 4 ht h ee x p r e s s i o no fCs u b u n i ti n c r e a s e d ，t h ee x p r e s s i o no fA 融a s e d ，t h ec h a n g e so fr e g u l a t o r yBf a m i l i e sw e r ev a r i o u s K 掣w 9 i d 豁P r o t e i np h o
6、 s p h o t a 2 A , r 商c r o c y s t i nL R ，M r t m , R e a l t i m e 争缀t l 引言 蛋内磷酸酶2 A ( P r o t e i np h o s p h a t a s e2 4 ，P P 2 A ) 烂粪棱生物体内S e r T h r 蛋翔磷酸酶。麓调搬绝 大多数S e r T h r 蛋囱激麟的活性。在纲匏代谢、纲胞分化、缓胞增皴、纲胞澜宅、纲跑转化漱纲胞捌亡 簿生瑗过程r 套嶷育痰蘩的调节榷用。 P P 2 A 节f ：聚俸翱兰壤体魏种彤式存瓷。囱髓化驻旗e ( 3 5 K D ) 翔浚絮踅照A ( 6 5 K
7、 O ) 缀成舱：= 黎体称为核心 酶，蹩纲胞中P p 2 A 孬嶷的粪体。链纯疆竭和支架链臻A 谮蠢n 和塾瓣种辩构体2 。第二兰个渡祭为调= 铃曛繁秘 ( 5 0 “ - - 1 3 0 K D ) ，分璃予B ，B ，l ! ；，8 四个溅族。冀分靠艇有组织特黔性。B 家族内Bn 、转、 By 、B 蓐图种辩构秫组成：B 豳B 5 6q 、8 5 6 B 、B 5 6Y 、8 5 6 为、8 5 6 瀛秘辩构倦甄溅iB 也摄 P R 7 2 、P R 4 8 。 其中，B 旺、B6 、8 6 6 哇、B 5 6Y 在器绻娥中广泛表达，B 叠、BY 、B 5 6 势、B 5 6s 皇螫在
8、蒸愈项目：溪寒翻然辩拳蕊垒矮H 0 0 7 7 1 8 2 7 ，2 0 7 7 7 0 6 7 ) 滋助。 僚蠢街舟：粱嫡1 9 8 4 一) 蜜，游士耕究繁；4 游说稼者E - m a i l ：x u l i h o n g z j u 。e d u 。C O 。 l 大腻中浚达3 5 。技心瓣A C 与不同的8 诬錾缭合形成了举醐的P P 2 全酶。转娩綦豹多样憋抉定爹它对P P 2 A 惫 酶形成、溉鳃臆淀挝、憾物专一性露决定性影响。 徽囊藻邀索怒蓝溱的臻属产生的淡生代谢产物，磊发生水华的水俸中这类毒滚镄遮存在。微囊藻海 豢对动物和人类都能产生辍为严壤的搿嘲，它诃以在簿常笳的时阀内引
9、起实验动物腊维髓环死，骶内出胤 6 。其中，徽蕤藻邂索潦憝疑巾存在较多、簿性较大的一张。实验试明，微囊溱褥豢跫嫒强的P P 2 A 摊制翔7 ， 遂豢巾特殊氨蕊酸W d h a ( m e t h y l d e h y d r o a l a n i n e ) 的不饱和羧基可萄糟烈e 诬麓漭挫挝点的带胱氰酸的巯 基戴价逑接形成鬣囱栩禽物。扶蕊影响P P 2 A 的瓣涵镶。赫秫结构分桥逐寝明，徽瀵藻海綮与e 诬纂滔谯健 杰的“翻袋”浚蔺的氨熬黢产裳了桐鬣作用8 。 荚”f 瓶与P 就A 的搠覆作用，已经有穰雾研究派明，儇对T - M C R 。冀瓣P P 2 A 备诬繁转浆承平的影响，还很少
10、撤邀。 零磷究通过蜜时定爨P C R 方法翁蒸探讨不同浓缆M 瓯R 姓理T P P 2 A 释诬繁的变纯，扶m R N A 承警搽讨凇抓对娅 撼交迭的黪嘲。 2 材料与方法 2 。l 材料 正常入羊膜细胞腿购- f A T C C ( A m e r c i a nT y p i c a lC e l lC o l l e c t i o n ) 。 2 。2 试剂 M E M 壤豢繁麴n O i b c o 公锢，掰盛! 牛斑消麴自毓州阏攀脊生物王程肖限公翊，麟蚤国酶购S e r v a 公 司，微囊藻辫粢拣购s i g m a 公闭，T r i z o l 购国t 海壤王，S Y B RP
11、 r i m e S c r i p tR T - R C Rk i t 鹃自弧K a R a 公阋， 牮I 物隆一k 海英骏生物有戳公矧合成。 2 。3 细稳培养及处理 F L 纲胞以禽I O 新燮牛赢淆彰J M E M 培养錾巍3 7 及5 C 0 2 的湿化结髀禳中避行培弊，隅天传代 次。蜜骏瓣躅的纲施均处予对黢生长期。檄獬燕验鹱求，细魏羧lx1 0 5c e l Fm L 的镶艘接秘予六孔掇上，生长 2 4 h 衍，程培莽体系巾分别加入M e L R 叠终浓度为0 、1 0 0 、5 0 0 、1 0 0 0 n m o i L ，作用时问为2 4 h 。 2 ，4R N A 的提瓤和
12、c D N A 的合成 按照T r i z o l 说明书提墩各处壤组细胞总R N A ，渊绽R N A 禽蕊。按照S Y B RP r i r n e S c r i p tR T - R C Rk k 说明 二 5 台成e D N A 。每2 0 1 , t l 艇成体莱加入l u gR N A 。 2 。5 实时P C R 檄据G e n b a n kL P P 2 A 嚣诬熬黪矧设计特筹性譬I 物( 袭I ) 。寅时P C R 反斑体系2 即he D N Alp l ，2 S Y B R P r e m i xE xT a q1 0 m ，1 0 p M 芬I 物备0 4 脚，汶魔7
13、 A B I7 0 0 0 袋光定鬣P C R 仅上进行，反感簧体为颡囊性9 5 。3 0 s ： 9 5 。1 5 s 5 6 。3 0 s ，7 2 。3 0 s ，戴进行绷个麓鄹。 2 袭I 各驻蒸实时定量P C R 扩增引耨序剿 s u b u n i IF o r w a r dP r i m e r s ( 5 - 3 )R e v e r s eP r i m e r s ( 5 - 3 )A c c e s s i o nN u m b e r C 旺 e 赋C A ( 葭门警t C G A G G G G Q C A G T G A G A G G A A G A T A G
14、 N M 一0 0 2 7 1 5 C p A G A G G A A A 下C A C G A A A G C C GC A G A A - r A T e 粥r A T C 飘e N M _ 0 0 1 0 0 9 5 5 2 。i A aG C 鲥e A A G A A G C 飘3 删A C CC A C C A G G G l _ A G T G A A G G r r N M 一0 1 4 2 2 5 。3 A B 弧端C G O r r F l A A T C G A C G A G C C T T T C T A C T C e A A G 下G C 丁 N M 一0 0 2
15、7 1 6 。4 B 旺心G 撇献 喝撼G 蟋G ：氍j“阿G 1 1 C 他C 玎G C 碱弼T N M J 黻7 i 7 2 B I B 蛾雠C 漩c c 凇c 氏域G 烈e A 薯A G G T T A A T e ( x N M 一0 0 4 5 7 6 。2 B yG 好A A G A 烈e e G A A A G A TC 凇C C A T W G e A A A G A T 馁T N M 一0 2 0 4 1 6 3 1 3 6A G 飘G C A A A G G G A e C A j 1 T C A C e G A C A G G T A G 糙下e 灌憨 N M 一0 1
16、8 4 6 1 2 B 5 6 aA C G 蟊e 笮健A e C c G G A A 叠潆G A A G T G G C A T C 下l 可珏A G C T N M 一0 0 6 2 4 3 。2 B S 6 B A C r 冒e r 麟；A C T G T G T G O C CC A A A l l C A O G Q T T C 程A C 零G G N M 一0 0 6 2 4 4 2 B 5 6 T A G T T A C G T C A G T G 丁I C GT A G G A T l 毽G A G G A A G G T G G N M 一0 0 2 7 1 9 ，2 B 5 6 鑫A C T T C G T G T C A G A C C C A C T CA T T C G 煳A A 6 a 零O G e A G e N M 一0 0 6 2 4 5 2 B 5 能A C 撤A 嘲A e A e ( 辩罩A 灌
