免疫组化ICH.

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1、免疫组织化学及其应用,概 述 1免疫组织化学概念,免疫组织化学(Immunohistochemistry) 又称免疫细胞化学，其主要原理是用荧光素、酶、胶体金等标记的抗体检测细胞或组织内的相应抗原，经过组织化学的呈色反应之后，用光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察，进行定性、定位或定量分析。 通过免疫组织化学手段，凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内将其检出和对其进行研究。,2免疫组织化学的相关理论和技术 2.1 免疫组织化学的工作原理 抗体与其抗原特异性结合 通过化学反应使特异性抗体标记上显示剂，如酶，金

2、属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色） 借助光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色或电子密度等变化，从而确定抗原在组织、细胞内的定位和含量。,2.2 免疫组织化学的全过程包括：, 抗原提取和纯化 免疫动物或细胞融合（单克隆抗体） 抗体效价检测和抗体纯化 标记抗体 细胞和组织切片标本的制备 免疫组织/细胞化学反应和显色 观察和记录结果,抗体(antibody) 多克隆抗体(polyclonal antibody) 纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔） 多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 特异性不如单克隆抗体好，有时会造成一定的交叉反应，但灵敏度高于后者。 能广泛用于石蜡包埋组织切

3、片。 单克隆抗体(monoclonal antibody) 单克隆抗体是由一个B淋巴细胞克隆分泌的针对一种抗原决定簇的抗体。 大多数为小鼠Ig。其优点为特异性强、抗体产量高。但灵敏度逊于多抗。 单克隆抗体只针对抗原分子的某一个抗原决定簇（这一抗原决定簇可以是抗原分子上的无关抗原决定簇）。 在免疫组织化学中广泛用于冰冻切片和石蜡切片。,常用标记物 1酶 为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件：底物是特异性的，且易于显示；酶反应产物稳定，不易扩散；容易获得纯酶分子且较稳定；酶标记抗体后，不影响两者的活性；被检组织中不应存在内源性相同的酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷

4、酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。 2荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）、PE等。 3生物素 与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。 4金属标记物 如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。,2.3 免疫组织化学组织细胞处理 切片前的准备工作,(1)载玻片的清洁： 市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240烤2 h。 (2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）： 干净载玻片丙酮5mi

5、n APES（1ml+ 50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或4保存备用。,石蜡组织切片中抗原性的修复： A、化学方法： 胰蛋白酶（0.050.1% ，含0.1%CaCl2） 蛋白酶K B、物理方法 单纯加热法： 高压加热法： 微波方法： 柠檬酸盐缓冲液,2.4 常用免疫组织化学方法： A、一步法 B、二步法 C、三步法 D、多步法,一、免疫荧光法,用荧光染料作为标记物，最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)。将FITC标记的特异性抗体和组织切片上的相应抗原结合，在荧光显微镜下观察，FI

6、TC呈现黄绿色荧光，代表所鉴定抗原的定位。FITC为黄褐色粉末或结晶，最大吸收波长为490nm，最大发射波长为520nm。 免疫荧光法分为直接法和间接法（二步法）。,二、免疫酶法,用酶标记抗体，在组织切片上进行特异的抗原抗体反应后，用组织化学方法使标记的酶催化相应的底物，生成有色产物，在显微镜下观察，可间接地对抗原物质进行定位。标记抗体常用的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等，以辣根过氧化物酶作为标记物更常用。,常用的免疫酶（染色）方法,免疫酶标法,PAP法主要染色原理 ： 用第二抗体作“桥梁”，既与第一抗体结合，再与PAP复合物联接，最后用底物显色剂显色。,非酶标法：PAP法,抗原与抗体分子的

7、结合，不受两者数量比例的限制，但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需保持一定比例。 在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可见的反应。 （BIG BEE现象）,亲和免疫组化 葡萄球菌蛋白A（SPA法）：用SPA代替桥抗体 卵白素生物素过氧化物酶复合物法 (Avidin Biotin-peroxidase Complex, ABC) ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合，再与ABC复合物联结形成抗原抗体生物素

8、化二抗ABC。最后用底物显色剂显色。, 用链霉菌亲和素代替ABC复合物中的卵白素，则为： 法：(StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex) 将链霉亲和素和生物素先连结起来，则称： 法：labelled StreptAvidin-Biotin 用链霉亲和素连结辣根过氧化物酶，则为： 法：(StreptAvidin Peroxidase conjugataed method) 若用碱性磷酸酶标记链霉亲和素则称法。 若分别用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，则称法 特点: 敏感性高，（比高倍）； 背景淡，链霉亲和素更好； 方法较简便，时间较短； 应用范围广

9、，也可用于原位杂交和免疫电镜。,步骤： (1) 石蜡切片脱蜡至水后； (2) PBS浸洗，5min3次； (3) 3%过氧化氢溶液，10min；（去除内源性过氧化物酶） (4) PBS浸洗，5min3次； (5) 滴加10%正常非免疫动物血清（与二抗同源）10min（封闭）； (6) 倾去血清，不洗！加第一抗体，37，30-60min； (7) PBS浸洗，5min3次； (8) 加生物素化二抗，4560min； (9) PBS浸洗，5min3次； (10) 加ABC复合物，4560min； 或 (10)每张切片加1滴或50l链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，10min； (11) PBS浸

10、洗，5min3次； (12) 新鲜配制的DAB-H2O2溶液，310min； (13) 自来水冲洗，复染，中性树胶封固。,显示剂的合理使用 目前最常用的显示剂 用于辣根过氧化物酶（HRP）系统 DAB： 3.3-diaminobenizidine（3、3-二氨基联苯胺盐酸盐） AEC： 3-amino-9-ethlylcarbazde（ 3-氨基-9-乙基卡吧唑） 用于碱性磷酸酶（AP）系统 BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)NBT(硝基四氮唑蓝) AP-Red和Fast-Blue （ 萘酚AS-BI磷酸盐快红或快蓝） AEC溶于酒精，所以封片时不能用中性树胶，以免退色，而只能用甘油明

11、胶或市售的AEC封片剂。,其它： 免疫金银法 放射免疫自显影法 葡聚糖聚合物技术 EPOS(enhanced polymer one-step stain)法：一步法 EnVision法或ELPS法 （enhanced lablled polymer system）：二步法 免疫组化染色阳性信号的原位放大 （catalyzed signal amplification，CSA）,三、免疫组织化学的质量控制及 注意事项 1. Ab的保存和配制 保存性分装 即用型 配制,2正确的设计和结果判断 对照原则： 替代对照要注意相同的原则；阳性结果阴性对照，阴性结果阳性对照；染色清晰，定位准确。 阳性对照

12、： 阴性对照： 自身对照：,正确设计对照方法,阴性对照： （）空白对照：用置换第一抗体； （）血清替代对照：用同种动物正常血清代替第一抗体； （）同型抗体对照：用未免疫同种动物的Ig代替第一抗体 （4）抑制对照：用未标记的抗体先和相应的抗原结合； （5）吸收对照：用纯化的抗原对抗体先行吸收； 阳性对照：用已知或已被实验证明为阳性的组织； 自身对照：利用组织切片内的各种不同的组织成分作对照。 在病理科的日常诊断工作中，只要有阴性对照和阳性对照即可。,出现假阳性的几种原因 1、酶-底物反应时间过长； 2、切片洗涤不充分，或在孵育中切片干燥； 3、抗体的交叉反应：抗体特异性不够，或本身含有与人体组织

13、发生交叉反应的成分； 4、非特异性反应：边缘现象、皱折和刀痕、出血和坏死等； 5、内源性过氧化物酶干扰：红细胞、炎细胞、退变坏死细胞和某些腺上皮分泌物，以及某些富含过氧化物酶的组织，如脑、肝等；,出现假阴性的几种原因 1、抗体和检则试剂盒配对是否合理。如单克隆抗体（多为鼠），其检测试剂盒应该用鼠的试剂盒，多克隆抗体（多为兔）应该用兔的试剂盒。 2、抗体的浓度太低或久置失效。 3、孵育的时间太短。 4、固定和温度：组织固定不当或固定时间过长，温度偏高。 5、染色步骤是否正确，如 DAB或H2O2的浓度不当及失效。 6、染色过程中切片过分干燥。 7、需要抗原处理而没有处理。,出现背景着色的几种原因

14、 1、内源性过氧化酶没有完全阻断。 2、正常动物血清使用不合理，如第二抗体为羊抗鼠IgG，应该用羊的正常血清。 3、脱蜡不够彻底。 4、组织粘贴剂使用不当或太浓。 5、PBS冲洗不够。 6、抗体稀释不合理，浓度太高。 7、底物显以时间太长。,免疫组化的结果判断,免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。 阳性细胞的染色常定位于细胞，并与阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可有显著区别。,结果判断标准 必须掌握的一些原则： 阳性细胞定位是否正确？ 明确阳性分布：胞膜、胞浆还是胞核阳性 间质清晰，无背景着色。 阳性细胞要在5%以上，才能定为阳性。 参考评价： 50% + +,雌激素受体在乳腺癌的表达,EJ细胞PCNA表达,EJ细胞CDK6表达,GFAP阳性神经胶质细胞,体外神经胶质细胞培养免疫组化GFAP阳性,培养的成纤维细胞 微管呈绿色 核呈蓝色,海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 棕色(突触),