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1、第十二章 微生物学新技术在环境工程中的应用,内容提示 本章概要介绍酶、微生物制剂、生物表面活性剂、生物絮凝剂和沉淀剂等制备技术在环境工程领域的应用前景；可以提高处理效率，而且符合环保，愈来愈受到关注。 利用生物质能的微生物发酵产氢，提供清洁能源很有希望，有应用的可能性和实用性。,微生物学新技术,遗传诱变育种 基因工程 酶工程 微生物制剂 生物表面活性剂等的技术 生物絮凝剂和沉淀剂 此处简单介绍适宜在环境工程领域应用的几种。,第一节 固定化酶和固定化细胞在环境工程中的应用 第二节 微生物细胞外多聚物的开发与应用 第三节 优势菌种与微生物制剂的开发与应用 第四节 微生物能源的开发与应用,第一节 固
2、定化酶和固定化细胞 在环境工程中的应用,酶在微生物体内的一切生物化学反应中起着极其重要的催化作用，将它提取出在体外也能发挥其作用。故能将酶制成酶制剂，在食品加工、印染中棉布退浆、生丝脱胶，制革、制茶、化妆品、发酵工业、医疗、洗涤剂、污（废）水生物处理、废气生物净化等均可应用。根据各行业的需要可使用不同剂型的酶制剂。,一、酶制剂剂型,（一）干燥粗酶制剂 将用麸曲或深层发酵的培养液除菌（或不除菌）后，与淀粉等惰性填料混合、干燥制成粗酶。 （二）稀液体酶制剂 将培养液过滤除去菌体等杂质后，直接加稳定剂(甘油、乙醇、氯化钠等的复合物)和防腐剂作为商品出售。国内许多白酒厂用此种液态糖化酶制剂糖化淀粉。,
3、（三）浓液体酶制剂,将培养液过滤除去菌体等杂质、浓缩后再加稳定剂和防腐剂成商品。 （四）干燥粉状酶制剂 我国多数生产此种酶制剂。其制备工艺为：,（五）结晶酶 结晶酶是经过高度纯化而结晶的固体酶制剂。在酶溶液中缓慢加入硫酸铵或氯化钠而使溶液接近过饱和状态时，静置于低温（04）下就可析出结晶酶。 酶结晶的条件：酶蛋白浓度在350mg/mL,酶的纯度大于50。不同的酶的pH稳定范围不同。 （六）固定化酶,将酶和酶菌体固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，可较长时间使用。,二、酶的提取,（一）预处理 在提取酶之前要作预处理。不同的酶有不同的预处理方法。 1. 胞外酶的预处理和制备 存在培养液中，只需将菌
4、体过滤或离心去除，所得的清液即为粗酶液。如果是固态发酵麸曲，用水或缓冲液浸泡，再离心或过滤去菌体及杂物后所得清液即粗酶液。粗酶液再经提纯即酶精制品。 2. 胞内酶的预处理 胞内酶需要破碎细胞壁和质膜，然后制成无细胞提取液，再提纯。 破碎细胞的方法有：干燥法(空气干燥、真空冷冻干燥、溶剂脱水干燥)、机械法(研磨法、机械捣碎)、超声波破碎、反复冷冻法、自溶法、溶菌酶法。,(二) 酶的提取,酶是比较脆弱的物质，处理不当容易变性，提取前要对目的酶的等电点、pH、温度的稳定性、氧化还原剂对酶的影响有所了解。 1.水溶液提取法 用稀的盐溶液、缓冲液或水提取。稀盐、缓冲溶液和水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大
5、、是提取酶常用的溶剂，提取液的用量是培养液体积的15倍。在提取时要均匀地搅拌，以利于蛋白质的溶解。同时根据不同酶的性质控制好提取温度。多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，适当提高温度，但时间不宜过长，需缩短提取时间。避免温度过高导致酶蛋白质变性失活，一般在5以下操作。为了避免提取过程中酶被蛋白水解酶降解，可加入二异丙基氟磷酸和碘乙酸抑制蛋白水解酶活性。特别注意提取液的pH和盐的浓度。,（1）pH：酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，防止过酸或过碱而引起酶蛋白可解离基团变化，而导致酶蛋白构象的不可逆变化。碱性酶用偏酸性的提取液
6、提取，而酸性酶用偏碱性的提取液提取。 （2）盐浓度：稀浓度盐溶液可促进酶蛋白的溶解度，同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护酶蛋白不易变性的优点，在提取液中加入少量NaCl（0.15mol/L）或其他中性盐。缓冲液常采用0.020.05mol/L磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。,2.表面活性剂提取法,表面活性剂有天然的胆酸盐、磷脂，合成的有十二烷基硫(磺)酸钠(SDS、阴离子型)、二乙氨基十六烷基溴(阳离子型)、非离子型的有吐温(Tween)及三通X(TritonX)。 3.有机溶剂（丁醇）提取法 对不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中的，和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶，可用乙醇、
7、丙酮和丁醇提取，以丁醇最佳。丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；丁醇兼具亲水性；pH及温度选择范围较广，在溶解度范围内（注：0时其溶解度为10%，40时其溶解度为6.6%）不会引起酶变性失活。故需在低温下操作。,工业化生产蛋白酶（胞外酶）的提取操作步骤如图12-1。200 m3酶活力为200 u/mL的发酵原液,经过一系列提取步骤后制成了200 kg酶活力为165 000u/mL的成品固体酶，或制成1 m3酶活力为330 000 u/mL的成品酶液，其总收率为82 %。,图12-1 蛋白酶（胞外酶）工业提取流程图,三、酶的纯化步骤,提取的酶要先浓缩、去杂质再纯化。 （一）浓缩 浓缩的方法有葡
8、聚糖凝胶-分子筛浓缩法、聚乙二醇(PEG)浓缩法、超滤膜浓缩法、冰冻法、盐析或乙醇沉淀后分离。 （二）去杂质 去杂质的方法有：pH沉淀法、利用蛋白质热变性的温度差异、蛋白沉淀剂法。,（三）纯化,1. 盐析法 盐析法是用中性的硫酸铵(NH4)2SO4、MgSO4、NaCl、Na2HPO4纯化酶。绝大多数用(NH4)2SO4。 2. 有机溶剂沉淀法 在酶溶液中缓慢加入相当于酶溶液浓度的两倍的有机溶剂（乙醇或丙酮），以降低酶溶液的电解常数，以增加酶蛋白分子电荷间的引力，导致酶蛋白的电解度下降而沉淀。 3. 层析法 层析法有吸附层析法、离子交换层析法、分子筛过滤层析(凝胶过滤层析)法及等电点沉淀法。
9、（四）结晶 当酶达到一定的纯度后，在适当的温度、pH条件下，逐渐加入(NH4)2SO4溶液中，酶可慢慢析出结晶，也可加入某些有机溶剂析出结晶。,二、固定化酶和固定化微生物的固定化方法 (一) 固定化酶和固定化微生物,1.固定化酶 从筛选、培育获得的优良菌种体中提取活性极高的酶，再用包埋法(或交联法、载体结合法、逆胶束酶反应系统)等方法将酶固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，即固定化酶。,固定化酶的研究始于1910年，正式研究于20世纪60年代，70年代全世界普遍开展。至目前取得很多成果，但多限于简单的胞外酶水解酶类、少数胞内酶。固定化水解酶类对大分子降解能力强，对小分子无分解能力。胞内的氧化还
10、原酶类利用很少，发现2 100种酶中，有1/5的脱氢酶需要NAD+和NADP+辅酶同时存在才能充分发挥酶的作用。而酰胺类(NAD+和NADP+)辅酶的再生和固定化方法尚未解决。所以,多酶体系的固定化尚有待于研究开发。,2.固定化微生物,将酶活力强的微生物体固定在载体上，即成固定化微生物。 微生物体本身是多酶体系的固定化载体，将整个细胞固定化更有利于保持其原有活性，甚至可提高活性。有死细胞固定化和生长细胞固定化两种。 3.固定化酶和固定化微生物的特性 固定化酶和固定化微生物普遍比未固定化的微生物性能好，稳定、降解有机物性能强、耐毒、抗杂菌，耐冲击负荷等优点。制成酶布和酶柱后用于连续流运行，酶不会
11、流失。,（二）固定化酶和固定化微生物的固定方法,1.载体结合法 以共价结合、离子结合和物理吸附等将酶固定在非水溶性载体上。载体有葡聚糖、活性炭、胶原、琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝、羧甲基纤维素等。 2.交联法 酶与两个和两个以上官能团的试剂反应形成共价键的固定方法。交联剂有：戊二醛、双重氮联苯胺和六甲撑二异氰酸酯。 3.包埋法 将酶包埋在凝胶微小格子(格子型)中，或将酶包裹在半透性的聚合物膜内(微胶囊型)的固定方法。格子型的包埋材料：聚丙烯酰胺(PAM)凝胶、聚乙烯醇(PVA)、琼脂、硅胶、角叉菜胶(红藻提取物凝胶)等。微胶囊型的包埋材料有尼龙、乙基纤维素和硝酸纤维素。,4.逆胶束
12、酶反应系统,表面活性剂的两性分子在有机溶剂中自发形成聚集体，其亲水性一端连接成逆胶束的极性核，水分子插入核中，其疏水性的一端进入主体有机溶剂中，酶分子溶于逆胶束中，组成逆胶束酶系统。 以上四种固定化方法见图12-2。除上述四种单独的固定化方法外，还可将两种方法结合使用，能防止酶泄漏。,图 12-2 酶固定化的模式图 A.载体结合法 B. 交联法 C1.包埋法(格子型) C2. 包埋法(微胶囊型) D. 逆胶束酶反应系统,对微生物细胞的固定化最适合用凝胶包埋法。 固定化酶的酶型： 颗粒状的固定化微生物细胞，在连续流工艺中容易会流失。 制成酶布和酶柱，解决了酶流失问题。 酶和微生物的载体: 多糖、
13、纤维蛋白、水凝胶、空心纤维、多孔酚醛树脂。无机载体有多孔玻璃、氧化铝、羟基磷灰石 、硅氧化铝、多孔陶瓷、不锈钢和砂等。,五、固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用及前景,（一）固定化酶和固定化微生物在废水生物处理中的研究现状 鉴于固定化酶技术只限于水解酶类和少数胞内酶研制成功和应用，多酶体系的固定化技术尚未解决；又由于废水的组分很复杂，而且经常变化。因此，要用多种单一的固定化酶，包括胞外酶和胞内酶组合处理，才能完成某一物质的多步骤反应，才能使有机物完全无机化和稳定化。 固定化酶可以制成酶膜、酶布、酶管（柱）、酶粒、酶片。 处理动态废水用酶管为好。 废水中若含有多种毒物，可按分解毒物成分的次序
14、，沿着废水流动方向，依次按顺序将与各种毒物相对应的酶固定在塑料管内壁不同位置上，制成塑料酶管。见图12-3中所示。,废水中的氰化物被氰水解酶、甲酰胺酶、甲酸脱氢酶催化作用下，分解为CO2 、H2和NH3。其中的酚被酚氧化酶催化氧化为CO2 和H2O，结果氰和酚两种毒物能被同时清除，废水得到净化。 德国将9种降解对硫磷农药的酶共价结合固定在多孔玻璃珠、硅胶珠上，制成酶柱处理对硫磷废水，获得95%以上的去除效果。连续工作70d ，酶的活性没有变化。 说明多种酶的作用大于单一种酶的作用。,图12-3 四种固定化酶在酶管中排列顺序示意图 1.氰水解酶 2.甲酰胺酶 3.甲酸脱氢酶 4. 酚氧化酶,日本
15、用固定化-淀粉酶处理淀粉废水和造纸白水。 美国将固定化酚氧化酶处理含酚废水，固定化酶活性只达到游离细胞的90。从这个意义讲，用游离细胞处理废水的效果比用单一固定化酶的好。 一个微生物体本身就是多酶体系的载体。在废水生物处理中已知：单一种微生物并不能将某一种废水净化彻底。需要多种微生物混合生长组成微生态系，依靠食物链净化废水。 同理，制备多种混生的固定化微生物对提高处理效果无疑是有益的。,(二) 固定化酶和固定化微生物在废水生物处理中应用的可能性 城市生活污水和工业废水的水量大，用固定化酶或固定化微生物处理有难度，但应用于小水量的特种工业废水处理有可能实现。 废水处理中的生物膜实质是在各种材质的
16、填料上被固定化了的混生微生物群体。这种固定化不是被包埋在载体内部，而是固定在载体的表面，类似于图12-1，A所示的载体结合法。因固定在载体表面，直接与废水接触，相对上述的固定化酶和固定化微生物，在耐毒和耐冲击负荷方面可能要差些。但相对于活性污泥其抗性则要强许多。,(三) 固定化微生物在废气生物处理中的应用前景 废气的组分没有废水的复杂，而且将废气由气相转化为液相所产生的废水量不大，其处理难度相对较小。恶臭含硫污染物和挥发性有机污染物均有固定化酶和固定化微生物处理的可行性试验，可望在生产中应用。,可选用的生物膜载体有：,生物膜载体有鹅卵石、煤渣、陶粒、活性炭(颗粒状、粉状、碳纤维)、纸质蜂窝、塑料波纹板、塑料空心球、软性的和各种构型的半软性塑料填料。 固定化（挂膜）方法有：自然挂膜、优势菌种挂膜和生物工程菌和遗传工程菌挂膜。在大量生产中，目前仍然是自
