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1、华中科技大学硕士学位论文B16小鼠免疫治疗后残余瘤组织中的MMP-2，MMP-9的变化姓名：彭慧敏申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张桂梅;冯作化20080501独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究作出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：彭慧敏日期：2008 年 4 月 10 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的
2、规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密（请在以上方框内打“”）学位论文作者签名：彭慧敏日期：2008 年 4 月 10 日指导教师签名：张桂梅日期:2008 年 4 月 10 日华中科技大学同济医学院硕士学位论文B16 小 鼠 免 疫 治 疗 后 残 余 瘤 组 织 中 的MMP-2,MMP-9 的变化硕士研究生：彭慧敏导 师 :张桂梅教授冯作化教授黄 波 教授中文
3、摘要目的：探讨采用 4 1BBL联合 sPD-1及单独使用 IFN-对 B16小鼠进行基因治疗，然后停止一段时间（ 7days），观察残余瘤组织中 MMP-2、 MMP-9的变化及借此评价治疗的效果。方法：将一定剂量的 B16癌细胞接种于C57BL/6 小 鼠 右 后 腿 肌 肉 内 ， 建 立 小 鼠 肿 瘤 模 型 ； 采 用 可 溶 性 PD-1（ sPD-1）和 4-1BBL， IFN-真核表达质粒于体内转染进行基因治疗；RT-PCR检测肿瘤微环境中 4 1BBL、 sPD-1、 IFN-基因的表达；称取治疗后的瘤重及停止免疫治疗观察残余瘤组织中 MMP-2、 MMP-9的变化 ;RT
4、-PCR检测肿瘤免疫基因治疗后残余瘤组织中 IFN-的表达；观察体外IFN-对 残 余 瘤 细 胞 中 MMP-2、 MMP-9表 达 的 影 响 。 结 果 ： 联 合 转 染4-1BBL/ sPD-1和 IFN-基因治疗后，接种一定剂量的 B16肿瘤细胞的小鼠肿瘤生长明显受到了抑制。在治疗 3周后停止治疗，残余瘤组织中 MMP-2,MMP-9于治疗结束时表达下降，于治疗结束一周后表达又明显上升，1华中科技大学同济医学院硕士学位论文IFN-于治疗结束时表达上升，于治疗结束一周后表达下降。结论：采用4 1BBL协同 sPD-1及 IFN-进行的肿瘤免疫基因治疗虽取得了明显成效，但在治疗过程中若
5、停止免疫治疗会导致肿瘤侵袭性的增加，这提示延长基因免疫治疗时间对于肿瘤疾病获得稳定的疗效是至关重要的。【关键词】4-1BBL； sPD-1； IFN-；基因治疗；侵袭性； MMP-2；MMP-92华中科技大学同济医学院硕士学位论文The changes of the MMP-2 and MMP-9 in the remnanttumor tissue after immunotherapy to B16Graduate: Student:PenghuiminSupervisor: Professor ZhangguimeiProfessor FengzuohuaProfessor huangb
6、oAbstractObjective The purpose of this study is to investigate the synergisticallytherapeutic effects of soluble PD-1 in combination with 4-1BBL and thetherapeutic effects of IFN- on melanoma and observe the invasive changesof the remnant tumor tissue after stopping therapy.Methods C57Bl/6 micewere
7、inoculated i.m. With invariably amount of B16 cells in the right hindthigh muscle to establish the experimental melanoma model. The eukaryoticexpression plasmids of soluble PD-1 (sPD-1) and 4-1BBL and IFN- wereinjected directly into the muscle for gene therapy, Observing the MMP-2,MMP-9 changes of t
8、he remnant tumor tissue after stopping therapy. Thephenomenon IFN- affects the expressions of the MMP-2 and MMP-9 invitro were observed. The expressions of 4 1BBL,sPD-1and IFN- genes intumor microenvironment were detected by RT-PCR.Results Thecombination treatment of 4-1BBL and sPD-1 produced strong
9、 inhibition ontumor growth. So did IFN-. We stopped the gene therapy until three weeks.3华中科技大学同济医学院硕士学位论文We noticed down-regulation of the expression of the MMP-2 and MMP-9and up-regulation of the expression of IFN-. But after a week, the resultswere reverse. Conclusion it were obvious that the syne
10、rgistically therapeuticeffects of soluble PD-1 in combination with 4-1BBL and the therapeuticeffects of IFN- on melanoma. the remnant tumor cells increases theinvasion when we stop the therapy during gene therapy. Therefore, itsuggests the prolongation of the time of gene therapy is important to sec
11、urethe stable therapeutic effects.【 Key words】4-1BBL; SPD-1; IFN-; the remnant tumor tissue;invasion; Gene therapy; MMP-2； MMP-94华中科技大学同济医学院前言硕士学位论文恶性黑色素瘤 (MM) 多发生在皮肤 ,恶性程度很高，发展迅速，预后差，死亡率高，对放疗、化疗均不敏感。临床治疗往往收效甚微 1。近年来，随着分子生物学技术的发展，恶性黑色素瘤的基因治疗也取得了显著的成效。按所用的基因可分为免疫基因治疗、反义核酸与抗癌基因治疗、自杀基因治疗及联合基因治疗 2。在本实验中
12、，我们采用的是免疫基因治疗。以往在对恶性黑色素瘤疾病模型的治疗研究中，我们曾用 4-1BBL联合 Hsp70-肿瘤抗原肽对恶性黑色素瘤小鼠的转移病灶进行治疗。研究发现： 4-1BBL联合应用 Hsp70-肿瘤抗原肽对小鼠黑色素瘤肺转移具有抑制作用，这种抑制作用主要是通过增强外周 T淋巴细胞的功能活性而达到的 3。 4-1BBL是体内重要的共刺激分子之一，与其受体结合后可参与 T细胞的活化、增殖和分化；增加细胞因子 IL-2和 IFN-等的分泌；促进细胞毒细胞的杀瘤效应 4。Kircheis等证明腺病毒介导 IL-2 + IFN-直接注射入荷瘤小鼠瘤体内 ,可以明显缩小瘤体或使肿瘤完全消退。虽然
13、 4-1BBL对恶性黑色素瘤的治疗作用是明确的，但是 4-1BBL在促进IFN-表达的同时也上调了抑制性分子 PD-1的水平，并且 4-1BBL并没有显著改变 TGF-和 IL-10的表达，这些负性调节因素对 4-1BBL发挥长期的疗效具有阻抑作用。 sPD-1能特异性结合 PD-Ls，阻断 PD-Ls/ PD-1相互作用，而间接增强杀瘤效应。因此，我们考虑把 4-1BBL和 sPD-1联合5华中科技大学同济医学院硕士学位论文表达以发挥其互补作用从而达到更加有效的治疗肿瘤的目的。鉴于我们以前曾将二者联合用于治疗小鼠实验性肝癌取得了显著的成效，因此，我们想要评价二者的联合表达是否在对恶性黑色素瘤的治疗中具有同样的疗效。同时，我们还要进一步评
