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1、泸州医学院 硕士学位论文 动脉粥样硬化兔主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道活性的变化及 前列腺素E对其影响的研究 姓名：朱宏文 申请学位级别：硕士 专业：内科学 指导教师：刘远厚 20040501 1 动脉粥样硬化兔主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道 活性的变化及前列腺素 E1对其影响的研究 摘 要 目的：动脉粥样硬化（AS）的形成机制和病理生理过程十分复杂。 目前认为 AS，尤其是粥样斑块形成时，血管通常以重塑（remodeling）机 制发生代偿性扩张，但代偿性扩张的确切机制尚未完全阐明。血管平滑肌 细胞钙激活钾通道（KCa）参与细胞膜动作电位的复极，对维持血管张力 具有重要的作用。至于 AS 形成过
2、程中，血管平滑肌细胞 KCa通道的电生 理特性如何变化，鲜见报道。本实验利用膜片钳单通道记录技术研究（1） AS 兔主动脉平滑肌细胞 KCa通道活性的变化， 旨在从分子水平上探讨 AS 血管代偿性扩张的可能机制和深化对AS形成的病理生理过程的认识。（2） 前列腺素 E1（PGE1）对 KCa通道活动的影响，以从分子水平上探讨 AS 时 PGE1的扩血管机制和意义。方法：(1)将 20 只健康的新西兰白兔随机 分为对照（Control）组和模型（AS）组，每组各 10 只，雌雄不拘，体重 1.00.15kg，月龄 34 个月。(2)AS 组喂高脂饲料（0.5%胆固醇+5%猪油 +15%蛋黄粉+7
3、9.5%普通饲料） ， 3 周后去除饲料中的胆固醇， 再喂养 5 周； Control 组只喂普通饲料，持续喂养 8 周。(3)用酶消化法获取单个主动脉 平滑肌细胞，通过膜片钳单通道记录技术检测 AS 兔主动脉平滑肌细胞 KCa通道的活性。在浴液中分别加入不同浓度的 Ca2+（10-8、510-8、10-7、 510-7、10-6M）和 PGE1(10-9、510-9、10-8、510-8、10-7M)，以 Pclamp7.0 应用软件实时采样记录通道的开放概率（Po） 、平均开放时间（To） 、平均 关闭时间（Tc）和电流幅值（Am） ，以药前作对照观察上述参数的变化。 结果：(1)KCa通
4、道的活性：在细胞吸附式膜片（cellattached patch）和内 面向外式膜片（insideoutside patch）下，Control 组和 AS 组 KCa通道的开 2 放均具有明显的电压依赖性。与 Control 组比较，AS 组 KCa通道的活性明 显增加。在对称性高钾溶液中，当膜电位钳制为+40mV 时，利用 cellattached patch 观察，Control 组和 AS 组 Po 分别为 0.03160.0205 和 0.24010.1215(P0.05)(n=10)，Tc 为 238.752203.253ms 和 19.861 12.524ms(P0.001)(n
5、=10) ， 电 导 为 205.650 37.125pS 和 195.225 42.825pS(P0.05)(n=10)，To 和 Am 变化均无显著性差异(P0.05)(n=10)。 在 insideoutside patch 下，Control 组和 AS 组 Po 分别为 0.01830.0085 和 0.16520.0764(P0.01)(n=10)，Tc 为 432.147192.637ms 和 52.193 19.880ms(P0.001)(n=10) ， To为6.635 2.523ms和8.0296 2.153ms(P0.05)(n=10)， 电导为258.85015.475
6、pS和262.02563.450pS(P 0.05)(n=10)，Am 变化均无统计学意义(P0.05)(n=10)。(2)KCa通道的钙 敏感性：利用 insideoutside patch 观察，Control 组和 AS 组 KCa通道均具 有明显的钙敏感性，并呈浓度依赖性。但与 Control 组比较，AS 组的钙敏 感性下降。在对称性高钾溶液中，当膜电位钳制为+40mV 时，在浴液中 加入不同浓度的 Ca2+（10-8、510-8、10-7、510-7、10-6M） ，Control 组 Po 由加 Ca2+前 0.01830.0085 分别增加到 0.02190.0108(P0.0
7、5)、0.0465 0.0190(P0.05)、0.10020.0240(P0.05)、0.16050.0651(P0.01)和 0.39010.0812(P0.01)(n=10)，AS 组 Po 由加 Ca2+前 0.16520.0764 分别 增加到 0.19010.0807(P0.05)、0.35200.0686(P0.05)、0.6014 0.0471(P0.05)、0.70810.0338(P0.01)和 0.84210.0318(P0.01)(n=10)。 与加 Ca2+前比较，Control 组 Po 增加了 22.35099.4338 倍，而 AS 组仅 增加了 5.31110
8、.4180 倍(P0.01)。(3) PGE1对 KCa通道活动的影响：在 inside-outside patch 下，PGE1可明显激活 Control 组和 AS 组 KCa通道，并 具有浓度依赖性。但 AS 组对 PGE1的反应性低于 Control 组。在对称性高 钾溶液中，当膜电位钳制为+40mV 时，在浴液中加入不同浓度的 PGE1 （10-9、 510-9、 10-8、 510-8、 10-7M） ， Control 组 Po 由加药前 0.01830.0085 3 分别增加到 0.01880.0069(P0.05)、0.04500.0119(P0.05)、0.0563 0.0
9、155(P0.01)、 0.11180.0315(P0.01)和 0.25330.0569(P0.001)(n=10)， AS 组 Po 由加药前 0.16520.0764 分别增加到 0.18300.0617(P0.05)、 0.32470.1326(P0.05)、 0.52440.1614(P0.01)、 0.67980.1817(P0.01) 和 0.80560.1937(P0.001)(n=10)。与加药前比较，Control 组 Po 增加了 14.81293.4079 倍， 而 AS 组仅增加了 5.14432.8612 倍(P0.01)。 结论： (1)AS 血管平滑肌细胞 KC
10、a通道的活性明显增加，可能是 AS 血管发生代 偿性扩张的机制之一。(2)Ca2+可激活 AS 血管平滑肌细胞 KCa通道，并具 有浓度依赖性，但在 AS 时该通道对 Ca2+的敏感性降低，可能是促进 AS 发生发展的因素之一。(3)PGE1通过激活 AS 血管平滑肌细胞 KCa通道而 发挥扩血管作用，但在 AS 时该通道对 PGE1的反应性降低，提示临床应 用 PGE1时应尽量做到个体化。 关键词： 动脉粥样硬化 膜电钳技术 钙激活钾通道 前列腺 素 E1(PGE1) 兔 4 Research of Changes of Calcium-activated Potassium Channel
11、s of Aortic Smooth Muscle Cells in New Zealand Rabbits with Atherosclerosis and Response of the Channels to Prostaglandin E1 Abstract：Objective：The mechanisms and physiopathologic process of atherosclerosis(AS) are very complicated. Presently, it is believed that the vasculature usually dilates comp
12、ensatorily because of vascular remodeling in AS, especially, the formation of atherosclerotic plaques. However, the mechanisms of compensatory vasodilation are not well known. Calcium-activated Potassium(KCa) channels in the membrane of vascular smooth muscle cells take part in the repolarization of
13、 active potential, and play a key role in maintaining vascular tone. How KCa channels change in vascular smooth muscle cells in AS, but there are few reports on this. In this study, the patch clamp technique was used to investigate (1)the changes of single KCa channel of aortic smooth muscle cells i
14、n New Zealand rabbits with AS, in order to determine the mechanism of compensory vasodilation in AS and enhance the comprehension about physiopathologic process of AS at molecular level. (2)the response of single KCa channel of aortic smooth muscle cells in New Zealand rabbits with AS to Prostagland
15、in E1(PGE1), so as to determine the mechanism of relaxing atherosclerotic vessels of PGE1 and significance. Methods：(1)Twenty Healthy New Zealand white rabbits were randomly divided into two groups, that is, the Control group and the AS group, regardless of sex. Each group had ten rabbits aged 3-4mo
16、nths and weighting 5 1.00.15 kilogram. (2)Rabbits from the AS group were fed with high fat fodder(0.5%cholesterin + 5%lard + 15%yolk power + 79.5%ordinary food), then the cholesterin in food was removed after three weeks. Ordinary food was fed to rabbits in the Control group. Both groups rabbits had been fed for eight weeks. (3)Single aortic smooth muscle cell was obtained by an enzymatical treatment. Patch clamp t
