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1、中国协和医科大学 博士学位论文 化疗药物增强TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡分子机制的研究 姓名：王明婕 申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：郑德先 20040601 Y 6 8 1 1 2 0 关于学位论文使用授权的说明 本论文中的图表、数据未经作者及单位授权请勿引用、复印、抄录。 作者签名。导师签名 日期 日期 中国协和医科大学博士研究生学位论文 _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ - - - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ - - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ h _ _ _ _ _ q _ _ _ _ 一 缩写词表 r s
2、T R A I L 8 A d o C I A c t D A p a f - 1 t B I 】 D I S C D M S O E C L E D T A F A D D H R P I A P M T S P A R P P B S P I P M A P M S P M S F P S P V D F B S A r p m F C S D T T E B H E P E S 甲m P E G R N a s e A S D S T A E T B E T E T E M E D P A G E P C R R O S A I F R e c o m b i n a n ts o l
3、u b l eT N Fr e l a t e da p o p t o s i si n d u c i n gl i g a n d 8 c h o r o a d e n o s i n e a c t i n o m y c i nD a p o p t o t i cp r o t e i n a s ea c t i v a t i n gf a c t o r s l T r u n c a t e dB I D d e a t h i n d u c i n gs i g n a lc o m p l e x D i m e t h y ls u l f o x i d e E
4、 n h a n c e dc h e m i l u m i n e s c e n c e E t h y l e n e d i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d F a sa s s o c i a t e dd e a t hd o m a i n p r o t e i n H o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e a p o p t o s i si n h i b i t o rp r o t e i n 3 “，5 一d i m e t h y l t h i a z o l 一2 一y i )
5、5 一( 3 一c a r c o x y m e t h o x y p h e n y l ) 一 2 一( 4 一s u l f o p h e n y l ) - 2 H t e t r a z o l i u m p o l y ( A D P r i b o s e ) p o l y m e r a s e P h o s p h a t eb u f i e rs o l u t i o n P r o p i d i u mi o d i d e p h o r b o lm y r i s m t e a c e t a t e P h e n a z i n em e t
6、 h o s u l f a t e P h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e P h o s p h a t i d y l s e r i n e P o l y v i n y l i d e n ed i f l u o r i d e B o v i n es e r l l l i la l b u m i n R o t a t i o n p e rm i n u t e F e t a lc a l fs e r u m d i t h i o t h r e i t o l E t h i d i u mb
7、 r o m i d e N 一2 - h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e N - 2 一e t h a n e s u l f o n i ca c i d M i t o c h o n d r i a lt r a n s m e m b r a n e p o t e n t i a l P o l y e t h y l e n eg l y c o l R i b o n u c l e a s eA S o d i u m d o d e c y ls u I f a t e T 6 s a c e t i cE D T Ab
8、u f f e r T m b o r a c i cE D T Ab u 疏r T r i s E D T Ab u f f e r N N N N - t e t r a m e t h y le t h y l e n ed i a m i n e P o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s a p o p t o s i si n d u
9、c i n gf a c t o r 中国协和医科大学博士研究生学位论文 中文摘要 T R A I L 是新发现的T N F 超家族成员，能诱导肿瘤细胞、转化细胞或病毒感 染细胞凋亡，而对正常细胞没有杀伤作用。因其能选择性杀伤肿瘤细胞而成为近 年来研究较多的潜在的化疗药物之一，但也有很多肿瘤细胞对T R A I L 的细胞毒 性耐受。本实验研究发现化疗药物8 氯腺苷( 8 C I A d o ) 和放线菌素D ( A c tD ) 可以 增强肿瘤细胞对重组可溶性T R A I L ( r s T R A I L ) 的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡。 首先，我们发现亚毒性剂量的8 C I A d o
10、 可增强肝癌细胞B E L 一7 4 0 2 对 r s T R A I L 的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡，并且呈作用时间和r s T R A I L 浓度依赖性。 进一步研究发现r s T R A I L 和8 C I A d o 联合作用，使肿瘤细胞出现G 1 期阻滞， 细胞凋亡增加。二者联合作用还可促进肿瘤细胞表面死亡受体D R 5 的表达，并 下调假受体D c R l ( d e e o yr e c e p t o r1 ) 的表达。在受体介导的信号传导途径研究中发 现，r s T R A I L 和8 - C I A d o 联合作用可激活c a s p a s e 依赖的和非依赖的
11、两条凋亡信 号传导途径。该联合作用还可抑制转录因子N F K B 的活性，抑制细胞凋亡。 对r s T R A I L 耐药的神经母细胞瘤细胞S H S Y 5 Y 先用亚毒性剂量的A c tD 处 理，再用r s T R A I L 处理，可促进该肿瘤细胞凋亡，其凋亡率随着r s T R A I L 的作 用浓度增加而增加。A c t D 预处理使细胞线粒体膜电位下降，加入r s T R A I L 后， 可使细胞线粒体内参与细胞凋亡的分子，如：R O S 和A I F 等释放，介导c a s p a s e 非依赖的细胞凋亡途径：同时还可活化c a s p a s e 一9 及其下游的c
12、a s p a s e 7 ，激活 c a s p a s e 依赖的细胞凋亡途径。在细胞凋亡途径中，B c l 2 家族抗凋亡分子B c l 2 和B c l - X L 表达下调，可能与细胞线粒体膜电位下降相关。采用R N A i 技术抑制 B c l - X L 表达不能增加细胞对r s T R A I L 的敏感性，提示B c I x L 不是S H S Y 5 Y 细胞 对r s T R A I L 耐药的关键因子。 根据以上实验结果可得出如下结论，8 一C 1 A d o 和A c tD 可增强肿瘤细胞对 r s T R A I L 的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡，甚至可使对r s T
13、 R A I L 耐受的肿瘤细胞变 成敏感细胞。r s T R A I L 和化疗药物联合作用，可通过上调死亡受体表达、降低线 中国协和医科大学博士研究生学位论文 粒体膜电位和释放促凋亡分子等方式激活c a s p a s e 依赖的和非依赖的细胞凋亡信 号途径。这一研究结果为深入理解化疗药物促进肿瘤细胞对r s T R A I L 敏感性的 分子机制提供了新的资料，为r s T R A I L 与化疗药物联合应用、减低化疗药物的 毒副作用和肿瘤的f | 缶床治疗提供了理论依据。 4 里塑塑堕型奎兰壁主塑塞竺兰堡鲨苎 A b s t r a c t P r o g r a m m e d c
14、e l ld e a t ho ra p o p t o s i si sa p h y s i o l o g i c a lp r o c e s so f c e l l u l a r a u t o - d e s t r u c t i o n A p o p t o s i sp l a y sc r i t i c a lr o l e si nd e v e l o p m e n t ，m a i n t e n a n c eo f h o m e o s t a s i s ，a n dh o s td e f e n s ei nm u l t i c e l l u
15、 l a ro r g a n i s m s ，D y s f u n c t i o no f t h i sp r o c e s s i si m p l i c a t e di nv a r i o u sd i s e a s e s r a n g i n gf r o m c a n c e ra n da u t o i m m u n ed i s o r d e r st o n e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e sa n di s c h e m i ci n j u r i e s E f f e c t i
16、v ei n d u c t i o no f a p o p t o s i so f c a n c e rc e l l si sa p r o s p e c t i v es t r a t e g yf o rc l i n i c a lc a n c e rt h e r a p y T u m o rn e c r o s i sf a c t o r ( T N F ) - r e l a t e da p o p t o s i s i n d u c i n gl i g a n d ( T R A I L ) ，an o v e lm e m b e ro f t h eT N F s u p e r - f a m i l y , i sap r o m i s i n g c a n d i d a t ef o ra n t i - c a n c e rt h e r a p ys i n c ei ti
