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1、分析化学前沿中热点 程介克 ( 武汉大学分析科学研究中心，武汉，4 3 0 0 7 2 ) 2 1 世纪是科学技术迅猛发展的新世纪，被称为“生命科学时代”和“高度信息化时代”。 新时代中的分析化学面l 临着巨大的挑战和机遇。近年来新兴的微型化纳米技术中微电子学、 显微光学及微工程学对分析化学带来巨大的冲击。 2 1 世纪分析化学在生命科学带动下，在纳化学( n a n o c h e m i s t r y ) 和纳米技术促进下，将 不断向微型化、图象化、联用化、时空化的方向发展。单分子及单细胞分析。以基因组及蛋 白组为代表的生物工程分析将成为分析化学前沿领域中热点之一。 本文将以单分子及单细
2、胞分析。基因组及蛋白组为代表的生物工程分析为中心，论述分 析化学向微型化、图象化、联用化、时空化发展的趋势 1 微型化 分析仪器愈来愈复杂庞大，因此小型化和便携化的仪器受到重视，但进展缓慢。1 9 9 0 年 M a n z 在硅片上组装出小型化液相色谱装置。在2 - 3e m 芯片上完成进样、分离、检测等分析过 程。故称为。微全分析系统”( m i c o t o t a la n a l y s i ss y s t e m s 。T A S ) 也称为“芯片实验室” L a b o i l aC h i p , L a bC h i p ) I l l 。pT A S 实现了现代分析化学
3、向微型化、集成化、一体化和自动化发展 的趋势。近几年迅速发展。1 9 9 4 年以来国际T A S 会议已召开过6 届。2 0 0 1 年创办了L a bC h i p 杂志。uT A S 已成为现代分析化学前沿中闪亮的热点，大大推动了分析化学微型化的发展。 微电子苍片加工技术在不断发展。三维散结构芯片已成功组装闭。纳米结构芯片也已开 发出。微流控芯片在细胞培养及操纵，临床诊断及法检分析、基因组及蛋白组分析等领域都 取得显著进展。 人类基因组计划的提前完成，分析化学发挥了关键作用。由于分析化学家研究开发出9 6 支阵列毛细管电泳D N A 测序仪( A B I3 7 0 0 型) ，大大加快了
4、D N A 测序速度。提前3 年于2 0 0 0 年6 月完成人类基因组工作草图宣布“生命之书”的诞生。美国加州伯克莱大学M a t h i e s 对 阵列通道电泳芯片D N A 测序进行了一系列研究最近他们提出的9 6 通道阵列电泳芯片D N A 测序系统，测序速度达到l O 万b p h p J 。比现在广泛应用的9 6 支阵列毛细管电泳D N A 测序仪 的测序速度提高5 倍。在1 周甚至l 天内可获得个人全部基因组谱图建立“个人基因卡”。 通过基因诊断及治疗，可使人们免遭癌症、心脏病及老年痴呆症等顽症的折磨。 芯片毛细管电泳超快分离。在高电场下0 8m s 分离了两种组分混合物。在单
5、分子检测中， 采用共聚焦荧光法检测荧光染料分子，检出限达p M 。采用光热光谱法检出限达到0 3 分子。 在微流控芯片上进行细胞培养，操纵及反应有一些报道。在含有阵列微进样器的微流控 芯片上，进行神经细胞培养。在微流控芯片上引入细胞检测A T P 诱导细胞释放钙( ) 。 电化学检测由于灵敏度高、选择性好、易微型化，可能成为“T A S 优先选择的检测技术。 采用微电子技术将铂、金、碳膜等电极组装在毛细管电泳芯片上，已应用于儿茶酚、酚、氨 基酸、肽、糖、P C R 产物、有机磷等方面。我们提出一种通用的芯片毛细管电泳电化学检测 系统，可根据工作需要，更换不同材料电极。多巴胺检出限5 5 X l
6、 f f7 m o l L 。超过文献报道的 灵敏度【4 】。采用紫外可见光度、化学发光、质谱、付里叶变换光谱、原子发射光谱、原子吸收 光谱、红外光谱、核磁共振等检测技术均已有报道【lJ 。最近还报道了激光荧光和电化学双检测 系统，用于同时检测多发性硬化病人脑脊髓液中儿茶酚及氨基酸。在微流控芯片上全集成毛 细管电泳电化学检测系统已有报道。 2 图象化 生命科学中分析化学常面临生物活体分析，如活细胞、生物活性分子等分析对象，因此 建立有效的活体、原位、实时动态分析技术日显重要。近年来图象分析的报道不断增长。 单细胞图象分析已经开发出多种途径。荧光显微镜法报道晟多，配备C C D 的荧光显微镜 获
7、得单个星形细胞中5 - 羟色胺的图象。采用3 光子激发荧光扫描显微镜实时得到鼠白血病活 细胞( R B L Z H 3 ) 中贮存5 羟色胺囊泡图象。S o n g 等p 1 采用荧光染料标记及共聚焦荧光成象 技术，发现新生鼠星形细胞能刺激成年鼠脑中干细胞产生新神经原，使神经原生长速度提高8 倍。这一研究为修复早老痴呆症脑组织提供了一条新的途径，引起人们重视。 单分子图象分析要求更高的灵敏度和分辨率。近场扫描光学显微镜的灵敏度能获得单分 子图象具有很高空间分辨率( 一1 5a m ) 。但仅用于表面分析，用于柔软样品仅得到有限的成 功。双光子激光共聚焦荧光显微镜可得到溶液中单分子清晰的图象。这
8、一技术为单分子检测 开拓了很多新的应用。全内反射荧光显微镜可以降低背景信号，已得到单个活细胞的细胞膜 上单分子图象。最近报道共聚焦荧光寿命图象显微镜对两种荧光染料单分子进行超高分辨定 位、精密度达到n m 级的新方法【6 J 。 应用灵敏的摄象机进行图象分析，常采用C C D 。我们在配备高分辨数码像机( 3 9 0 0 X 3 0 9 0 象素) 的倒置荧光显微镜( 2 0 0 M 型，Z e i s s ) 上获得单个肥大细胞( P C I 2 ) 放大近l 万倍的图 象。比I C C D ( 1 0 2 4 1 0 2 4 象素) 所得图象更为清晰。 时间飞行二级离子质谱( T O F
9、S I M S ) 可在单细胞水平获得原子及分子图象，如草履虫中 水、碳氢化合物、K _ 及N a + 。最近甩T O F - S I M S 得到P C I 2 细胞图象 7 1 。透射电子显微镜( T E M ) 已得到P C I 2 细胞及杂交细胞( N G | 0 8 1 5 ) 中囊泡图象，对囊泡的大小及体积进行了比较。 B a r d 对扫描电化学显微镜( S E C M ) 进行了一系列研究。晟近他们报道H R P 的S E C M 图 象，H R P 检出限达7 1 0 5 分子“1 。 3 联用化 分析化学面临愈来愈复杂的分析对象，在生命科学时代样品的复杂性达到高潮。园此各
10、种分离技术与检测方法联用更显重要。 近几年，芯片毛细管电泳与质谱联用已有报道。李建军等报道不同类型毛细管电冰芯片 与电喷质谱联用，并成功应用于蛋白质消解的肽分析。与纳电喷T O F - M S M S 联用进行了蛋白 质膜的痕量分析他们还提出了一个包括自动进样器、微流控分离器件及纳电喷质谱微分析 系统，可连续进样及分离3 0 个样品h ，用于蛋白质分析 9 1 。 微流控芯片与原子发射光谱联用报道有微波等离子体、微等离子体、脉冲等离子体等光 源。N M R 联用也有报道。 蛋白组分析十分复杂，目前广泛栗用二维凝胶板电泳及质谱分析法，烦亢费时。D o v i c h i 近几年来致力于单细胞蛋白
11、组分析”w 。最近他们开发出二维毛细管电泳自动化蛋白质分析系 统，在不同p H 缓冲介质电泳，用计算机控制二维毛细管电泳系统可检测荧光标记z m o l 蛋 白质 1 1 1 。S w e e c i l e r t n I 采用C E M A L D I - M S 联用及放射性检测技术，分离及鉴定了加州海洋软 体动物中单个袋神经细胞( 4 0um ) 中神经肽。在单细胞分析中为了提高分析通量，设计了 4 单细胞连续进样装置与C E L I F 联用，取得一定的成功。毛细管电泳与氢发生原子荧光光谱 ( C E A F S ) 联用，测定水、尿及沉积物中4 种形态砷，检出限9 - 1 8n g
12、 m L 。 联用技术关键在于接口技术。我们在c E 分离与电化学检测中，为了消除分离高电压对检 测的影响，提出了用氢氟酸刻蚀毛细管壁成多孔玻璃( 2 0pm ) 接1 ：3 新方法，取得满意的效 果。这一接口技术已被应用到c E 电致化学发光，C E E S I - M S 。最近Y e u n g “将其用于毛细管 电泳在线富集蛋白质及肽，认为此法简单有效。在c E 中采用场放大柱上富集更为简便有效。 我们在c E 化学发光检测中采用场放大进样，钒( ) 、钻( ) 、铬( m ) 的检出限达到a l I 水平， 可用于单分子分析。 4 时空化 2 1 世纪分析化学面临生命科学的众多挑战。
13、在生物微环境( 单细胞、细胞膜) 及超微环 境( 囊泡、突触) 中实时监测超微量生物活性物质的动态过程是一个严峻的挑战。必须研究 及开发高时间分辨及高空间分辨( 时空) 监测的新方法。我们对单细胞释放时空监测作过详 细评述【I ”。目前除极少数报道达到时空监测外，大量的工作仅限于时间分辨监测，细胞的直 径一般在1 0 - 3 0u m 之间，采用8u m 碳纤维电极难以作空间分布监测。我们研制的纳米电 极，在一般实验室中均易制作”应用此纳米电极首次对单个活细胞( P C I 2 ) 的胞吐释放进 行了时空监测。发现多巴胺信号在细胞表面分布有显著差异。并在自行设计的微流控细胞芯 片上，实现单细胞
14、的操纵定位。并对P C I 2 细胞中多巴胺的量子释放进行了实时监测。 光谱及时间分辨荧光检测首次用于4 种不同荧光染科单分子鉴定。检测单细胞中单分子， 可以增长我们对细胞内信号传导及基因转录等过程的了解。由于细胞是十分复杂的生物体系，因 此难度很大。已报道采用激光共聚焦荧光显微镜探测单个人癌细胞( H e L a ) 的细胞浆及细胞核中 荧光染料标记的单分子1 。 参考文献： 【I 】R e y e s D R ，I o s s i f i d s D ，M a n z A A n a l C h e m J l ，2 0 0 2 ，7 4 ：2 6 2 3 ；2 6 3 7 【2 】T i
15、 e nJ ，N e l s o nCM ，C h e nCS P r o c N a t l A c a d S c i U S A 啊，2 0 0 2 ，9 9 ：1 7 5 8 【3 】3P a e g e B M ，E m f i c h C A ，M a t h i e s R A P r o e N a t l A c a d S c i U S A _ 【J 】，2 0 0 2 ，9 9 ：5 7 4 【4 】Z e n gY W a n gzL ，C h e n gJkA n a l , C h e m 阴。2 0 0 2 ，7 4 ：2 4 4 1 【5 】S o n g H
16、J ，S t e v e n s CF ，G a g eF H N a t u r e 【J 】，2 0 0 2 ，4 1 7 ：3 9 【6 】6H e i l e m a n n M ，M u l l e r C ，S a u e r M ，A n a l C h c m 【J 1 ，2 0 0 2 。7 4 ：3 5 1 1 ( 7 1R o d d y T P , C a n n o nD M ，E w i n g A G A n a lC h e m 【- q ，2 0 0 2 ，7 4 ：4 0 1 1 【8 】8 Z h o uJF C a m p b e l lC ，B a r d A J ，A n a lC h e m J 】 2 0 0 2 ，7 4 ：4 0 0 7 【9 】L iJ J ，H a r r i s o n ，DJ ，T h i b a u l t P r o t e o m
