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1、人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体特性研究,本研究旨在探讨正常人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)分泌的外泌体(exosome)免疫调节功能及支持血管形成能力。 结论：BMMSC分泌外泌体具有免疫调节功能与支持血管形成作用。,背景知识,外泌体(exosome)为微小囊泡，直径大约20140nm，在生理或病理情况下，由多种细胞内膜(endosomal membrane)以出芽方式形成的多泡体，参与细胞间的信息交流，并参与到多种生理病理过程中。来源于不同的组织的外泌体不仅具有其特异性蛋白分子，而且还包含其行使功能的关键分子。 间充质干
2、细胞(MSC)，具有高度自我更新能力与多向分化潜能的多能干细胞，目前已应用于临床治疗心肌损伤性疾病、神经损伤性疾病等等。外泌体的主要功能是进行信息传递，因外泌体的特性与其来源细胞有关，现有研究已证明MSC分泌的外泌体在减少心肌损伤范围、保护急性肾小管损伤、促进神经再生、减少肺损伤等方面有重要作用。间充质干细胞具有独特的免疫调节功能，可抑制多种免疫细胞的功能，如T细胞、B细胞、NK细胞、抗原呈递细胞等分泌免疫调节因子，如IFN-、PGE2等。人骨髓间充质干细胞(hBMMSC)分泌的外泌体功能与其分泌细胞的功能息息相关，因此推测其在免疫调节与血管形成方面亦有重要作用。,主要实验流程,骨髓间充质干细
3、胞的分离及培养,外泌体的分离,外泌体的鉴定,外泌体miRNA提取及RT-PCR扩增反应,混合淋巴细胞实验,PKH26荧光标记外泌体观察与HUVEC间相互作 用,HUVEC网状结构形成实验,Matrigel体内成血管实验,统计学处理,HUVEC：人脐带静脉内皮细胞,Matrigel：基底膜基质,正常献髓者骨髓约5ml,无菌抽取,密度梯度离心法,骨髓单个核细胞,DF12完全培养液,重悬分离,接种于培养瓶中,收集第4至第6代细胞,DF12完全培养液：DMEM/F12、10胎牛血清、2umol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素/链霉素,骨髓间充质干细胞的分离及培养,外泌体的分离,血清,4过夜离
4、心,DF12完全培养液(EFM),不同数量的BMMSC,提取外泌体,PBS重悬,-20保存,共培养24 h,收集上清,PBS：磷酸盐缓冲液,外泌体的鉴定,分离纯化外泌体10ul,等体积PBS,稀释,2 mm的载样铜网,静置l min,3(w/v)磷钨酸钠溶液(pH 6.8)室温负染5 min,双蒸水轻轻洗一遍,室温晾干,透射电子显微镜观察并照相,15ug外泌体,5loadding buffer,75、5 min,SDS-PAGE凝胶,跑胶1.5 h,检测CD9表达,转膜,混合淋巴细胞实验,外周血15 ml,密度梯度离心法,单个核细胞,RPMI 1640完全培养液,重悬,终浓度5ug/mL植物血
5、凝素(PHA) 5 ng/ml重组人白介素2(rhIL-2),96孔板,加入BMMSC外泌体,37、5CO2,培养72 h,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中IFN-的含量,实验结果,(1)外泌体鉴定结果与定量 在透射电镜下观察到BMMSC外泌体呈圆形或椭圆形，直径约60160 nm(107223356)，有完整胞膜结构，内含低密度物质。western blot证实其表达外泌体表面标志CD9(图1)。细胞分泌的外泌体量与接种细胞数呈线性关系(图2)。,图1,图2,RT-PCR结果显示，BMMSC外泌体内含有miR301、miR-let-7a与miR22(附表)，而这些miRNA均与免疫相
6、关。BMMSC外泌体用ELISA试剂盒无法检测出其含有IFN-(结果未列出)，而与105/孔PBMNC共培养72 h后，对照组IFN-分泌量为(210942332)ug，实验组IFN-分泌量为(10914 4-2125)ug，两者间差异有统计学意义(P001)(图3)。此结果表明BMMSC外泌体能抑制PBMC产生和分泌IFN-。,(2)外泌体免疫功能,图3,在共聚焦显微镜观察可见外泌体被HUVEC摄取并分布在细胞核周围(胞浆)(图4)，在两者共培养时BMMSC外泌体明显促进HUVEC网状结构的形成，对照组为(45790035838)，实验组为(91496747070)，结果有统计学意义(P00
7、1)(图5)在裸鼠体内实验中，在外泌体组可明显见到血管生成，对照组无肉眼可见血管生成(图6)。,（3）外泌体支持血管形成,图4,图5,图6,在两者共培养时BMMSC外泌体明显促进HUVEC网状结构的形成，对照组为(45790035838)，实验组为(91496747070)，结果有统计学意义(P001)(图5)。,在裸鼠体内实验中，在外泌体组可明显见到血管生成，对照组无肉眼可见血管生成(图6)。,讨论,间充质干细胞(MSC)具有独特的免疫调节功能与多向分化潜能，决定了MSC在临床应用的主要方向。MSC可通过分泌细胞因子抑制多种免疫细胞的功能而应用于免疫系统相关疾病及干细胞移植中。作为具有多向分
8、化潜能的成体干细胞，MSC亦通过分化为成体不可再生细胞(如神经细胞)等治疗相关损伤性疾病。以往研究MSC作用时多集中在直接接触或分泌细胞因子，而现在研究发现外泌体亦参与到细胞间的信息交流。外泌体为细胞分泌的膜状结构，现已证明来源于不同的组织的外泌体不仅具有其特异性蛋白分子，而且还包含其行使功能的关键分子。 MSC可以抑制淋巴细胞产生和分泌IFN-，我们实验结果也证明在培养PBMNC时，加入BM-MSC分泌的外泌体能抑制其产生IFN-，这说明外泌体可能是其中一个作用机制。miR301a为NFKB通路关键分子，与肿瘤迁移、炎症反应有关。 BMMSC外泌体可以促进HUVEC向血管结构形成，这在临床上有重要应用价值，如对缺血损伤性疾病等等。,
