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1、细胞生物学实验方法与技术,METHODS AND TECHNIQUES OF CELL BIOLOGY,内容提要,第一节 显微技术 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、扫描隧道显微镜 四、显微操作技术 第二节 生物化学与分子生物学技术 第三节 细胞分离技术 第四节 细胞培养与细胞杂交,第一节 显微技术,光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。 扫描隧道显微镜：隧道效应（隧道电流）,Robert Hooke,1690年,1720年,1725年,1760年,1790年,1881年,1840年,1890年,Large Student Microscope made by
2、 Charles Chevalier 1840,Bausch & Lomb Investigator microscope circa 1893,1752年，英国人J. Dollond 发明消色差显微镜。 1812年，苏格兰人D. Brewster 发明油浸物镜，改进了体视显微镜。 1886年，德国人Ernst Abbe 发明复消差显微镜，并改进了油浸物镜，至此普通光学显微镜技术基本成熟。,现代显微镜,1932年，荷兰籍德国人F. Zernike成功设计了相差显微镜（phase contrast microscope)，并因此获1953年诺贝尔物理奖。,1932年，德国人M.Knoll和E.A
3、.F.Ruska发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm的商品电镜。,TEM,电子显微镜下的蚊子,1981年，瑞士人G. Binning和H. Rohrer在IBM苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。,Cs atoms (red) on the GaAs(砷化镓) surface (blue).,诺贝尔奖：Ernst Ruska，Gerd Binning和Heinrich Rohrer（从左至右）分别因为发明电子显微镜和扫描隧道显微镜而分享1986年的诺贝尔物理学奖,显微图片分别
4、由普通光学显微镜、电子显微镜和扫描隧道显微镜拍摄。按从上到下、从左到右的顺序，他们分别是：集成电路的局部、青霉、用原子排列而成的“原子”、神经细胞、T4噬菌体、蜜蜂关节局部、月尘、圆藻、硅藻土。,、光学显微镜, 光学显微镜的种类 根据借以成象的光学性质可分为： 可见光显微镜利用光谱的可见部分成像（390760nm） 不可见光显微镜利用390nm以下（紫外光显微镜），760nm以上光线成像（ 红外光显微镜）以及X射线成像。 根据显微镜照明技术可分为： 明视野显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜。 根据显微镜成象技术可分为： 相差显微镜、干涉显微镜、微分干涉反差显微镜、偏光显微镜。 根据显微镜的镜体构
5、造可分为： 倒置显微镜、实体显微镜、比较显微镜、激光扫描显微镜 上述各种显微镜都是在一般复式显微镜的基础上设计改造的，是依研究目的不同而制造的具特殊功能的显微镜。,1. 构成： 照明系统 光学放大系统 机械装置,（一）普通光学显微镜, 基本构造：光学放大系统、照明系统、机械和支架系统,尼康E-600显微镜,2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。, 光学显微镜成像原理,3. 分辨率：指分辨物体最小间隔的能力。 R=0.61/NA,其中为入射光线波长；NA为镜口率（数值孔径） sin，n=介质折射率；=镜口角（孔径角）（样品与物镜有效直径的边缘的张角） 。 思考：如何提高显微镜的分
6、辨能力？,表一、几种介质的折射率,表二、不同光线的波长,显微镜的几个光学特点： 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。 sin 的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 普通光线的波长为400700nm，分辨率数值不会小于0.2m（ R=0.2m是光镜的极限，显微镜无论制作的如何精密，都无法突破这一极限）；人眼的分辨率为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。,放大倍数 是眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值，（指长度） 目镜放大倍数MF目=250 mm （明视距离）/F，目（
7、目镜焦距） 物镜放大倍数MF物=160 mm（标准光学筒长）/F，物（物镜焦距）。 总放大倍数MF总=标准光学筒长/F，物250/F，目。,F,目不能太短，因为人眼瞳孔要与出射光孔重合，一般在10 mm以上，放大率不高，约在（250/10）25，光学筒长（A）也不能无限延长，所以只有靠减小F,物来提高总放大倍数。 由于分辩率（R）的限制，光学显微镜总放大倍数也不能随F，物的减小而无限增大。即光镜有效放大倍数受到分辨力限制，只要将R=0.2m，放大到人眼分辨率（0.2 mm）大小，便能观察该物体。0.2 mm 1000/0.2m=1000（倍），超过此界限继续放大，人眼就看不清其细节，是模糊的空
8、放大，无意义。, 有效放大： 上限：物镜镜口率1000 ； 下限：物镜镜口率250； 可变光阑（光圈）可调节开孔大小使聚光镜的N.A适应于物镜的N.A，如果聚光镜的N.A小于物镜N.A，则造成物镜NA不能充分发挥。 正确匹配目、物镜，以保证物象清晰度。 显微镜适合的放大倍数 决定于物镜的数值孔径，一般应为NA的500-1000倍，M=NA（500-1000）。另在选择放大倍数时，一定注意镜头的匹配，在物镜与目镜的组合中，目镜有效放大倍数为： M=目镜倍数（O）物镜倍数（B） OB=NA（500-1000） O=NA（500-1000）/B。,焦点深度 在视野中垂直范围内能观察到的界限。也就是调
9、焦看清楚某一物点时，不仅这一点清楚，此点的上下两侧也能看清楚，能看清楚的厚度称为焦点深度。以下式表示： d=Kn/MNA K常数，约0.24mm； M为总放大倍数； n为介质折射率 从上式看出，放大倍数愈高，数值孔径愈大，则焦点深度愈浅。 工作距离 指从物镜镜面表面到盖玻片上表面之间的距离。在物镜孔径一定的条件下，工作距离越小，孔径角就愈大，数值孔径也越大，所以高倍镜工作距离很小。 镜像亮度和视场亮度 镜像亮度：指镜下图像的亮度。 视场亮度：镜下整个视场的明暗程度。除与目、物镜有关外，还与聚光镜、光阑、反光镜和光源有关。,反差（contrast） 指观察物与背景的对比程度。在光镜和电镜有所不同
10、。 在光镜（光学像）： 由于被检物各部分结构不同，因而吸收或反射光线强弱程度差异而引起“亮度差”或“色度差”。 在电镜（电子像）： 由于被检物各不同部位对入射电子具有不同散射度而引起“浓淡差”。（电子束基本上是单色光，它与被检物之间不产生色的反应，在像中显示出来的仅是浓淡差别）。,（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope,特点：光源为紫外光或蓝紫光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。,Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in g
11、reen,用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。,荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色），,（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。,Confocal Principle,观察方式：以荧光为主 光源：激光（紫外、可见光、近红外） 照明方式：点照明、逐点扫描 成像方式：共聚焦、逐点成像 输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分
12、析 多重染色样品的观察,LSCM的基本特点,laser confocal scanning microscope, LCSM,LCSM Image of a Xenopus Melanophore （非洲爪蟾的黑素细胞） microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) http:/www.itg.uiuc.edu/,（四）暗视野显微镜 dark field microscope,聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 可观察 4200nm的微粒子，
13、分辨率比普通显微镜高50倍。,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。,（五）相差显微镜（phase-contrast）,原理,用途：观察未经染色的玻片标本,（六）偏光显微镜polarizing microscope,用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。 光源前有偏振片（起偏器
14、），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器 （与起偏器方向垂直的偏振片）。 载物台是可以旋转。,淀粉,偏振片,Z,用偏振片获得偏振光 是最实用的一种方法,起偏器,检偏器,P1,P2,双折射,O光（寻常光）遵守折射定律 e光（非常光）不遵守折射定律,（七）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）,1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。,DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）,较大的细胞器，如核、线粒体等
15、 ，基因注入、核移植、转基因等的显微操作 。,A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM. a)under bright-field; b)phase-contrast; c)DIC,尼康E800荧光DIC显微镜,（八）倒置显微镜 inverse microscope,物镜与照明系统颠倒，一般在载物台之下，倒置在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。,莱卡倒置显微镜,（九）当代显微镜的发展趋势,采用
16、组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。 自动化与电子化。,自从1933年第一台电子显微镜在德国诞生以来，取得飞跃发展并在生物学领域中得到广泛的应用，利用电镜人们不但可以观察到各种病毒的形态结构以及细胞器的微细结构，还能观察到许多生物大分子，甚至看到了单个重金属原子。目前的电镜已由单纯的形态描述进入了成分分析、定性和定量分析。此外，将电镜与计算机连用，对图象进行信息处理也取得了很大进展。总之，电镜已成为研究生物学的有力工具，必将发挥越来越大的作用。,二、电子显微镜,当电子入射至样品时，有下列几种情形： 1 其中一部分电子几乎不损失其能量，在样品表面被散射回来，这部分电子称背散射电子。 2 如果样品非常薄，入射电子的一部分将会穿过样品而成为透射电子（TE）。 3 其余电子的能量在样品内消耗而为样品所吸收，称为吸收电子。 X射线 4 入射电子将样品中的表面电子打出样品表面，产生出能量很小的所谓二次电子（SE），其中也包括由于俄歇效应而产
