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1、东北农业大学 硕士学位论文 农用抗生素尼莫克汀高产菌株的推理选育 姓名：王则 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：王相晶 20090620 摘 要 I 摘 要 尼莫克汀（Nemadectin）是一种十六元大环内酯类抗生素，由蓝灰链霉菌 Streptomyces cyaneogriseus sp. noncyanogenus 经发酵过程生产。作为米尔贝霉素族的一员，尼莫克汀主要 用于合成活性更强的农药兽药莫西克汀（Moxidectin）。本论文运用推理选育的方法筛选尼 莫克汀高产菌株，然后运用正交设计方法对培养基和培养条件进行优化，确定了适合于高产 菌株的发酵参数，为产业化
2、生产提供参考。 首先对尼莫克汀产生菌原始菌株进行两次纯化，使遗传性状稳定，以纯化后的菌株 N-03-16 为出发菌株，经紫外诱变进行推理选育。根据尼莫克汀的生物合成途径和代谢调节 机理，选择乙酸钠、缬氨酸、缬氨酸氧肟酸和 2-脱氧葡萄糖作为筛选压力，结合分离纯化， 得到菌株 N-09-20，产量达到 77 mg/L，比原始菌株提高了 4 倍。同时对比了内源性前体诱导 和结构类似物耐受的筛选效果。之后经过链霉素抗性筛选得到菌株 N-11-37，产量达到 99 mg/L，较出发菌株 N-09-20 提高了 28.6%，由此建立了链霉素筛选模型。以 N-11-37 为出发 菌株，经过 4 次自身代谢
3、产物耐受，筛选得到高产菌株 N-16-19，产量达到 172 mg/L，比原 始菌株提高了 10 倍， 成功的应用了自身代谢调节突变筛选模型。对菌株 N-16-19 进行了遗传 稳定性试验，经过 5 次传代后，结果表明该菌株有良好的遗传稳定性。 对高产菌株 N-16-19 的发酵条件进行了优化，确定了一系列发酵工艺。经过配方优化之 后，确定了新的斜面培养基和发酵培养基组成。在新的斜面培养基上，孢子形态为青灰色， 圆形，菌丝产黄绿色色素。优化后的发酵配方为（g/L） ：葡萄糖 20、乳糖 30、麦芽糊精 40、 玉米淀粉 20、蛋白胨 2、黄豆饼粉 4、棉籽饼粉 8，CaCO3 3，pH 7.0
4、，使用自来水配制。在 新的发酵配方下，尼莫克汀的产量达到 236 mg/L，比原始配方提高了 67%。同时，确定了菌 龄、接孢量、种龄、移种量和发酵温度等发酵过程参数，同时对溶氧要求进行考察，得知该 菌株对溶氧水平要求很高。通过短链脂肪酸前体和氨基酸前体的添加，考察了尼莫克汀产生 菌对前体的利用情况，并且确定在 72 h、120 h、168 h 分 3 次添加总量为 0.2%的乙酸钠，以 及在 48 h、96 h、144 h 分 3 次添加总量为 0.3%的缬氨酸时，尼莫克汀的产量有大幅度增加。 研究了在新的发酵工艺下尼莫克汀产生菌发酵过程中的产素变化，以及生物量、pH、总 糖、还原糖和氨基氮
5、的代谢变化。确定了发酵过程中，72 h 开始产素，在 96 h 发酵液由棕黄 色渐渐转为墨绿色，发酵 192 h，尼莫克汀的产量达到最高，此时菌体形态呈现老化，中空， 染色浅。在发酵过程中，当 pH 值超过 7.5 时，菌丝断裂，产素停止；当菌体浓度超过 30% 时，不利于产素。这些摇瓶发酵过程参数为工业化放大生产提供了参考。 关键词 尼莫克汀；推理选育；乙酸钠；缬氨酸；缬氨酸氧肟酸；2-去氧葡萄糖；链霉素 Abstract II Improvement of Agricultural Antibiotic Nemadectin- Producing Strain by Rational Sc
6、reening Abstract Nemadectin is a kind of 16-membered ring polyene macrolide antibiotics, and it is maily produced by Streptomyces cyaneogriseus subspecies noncyanogenus. In this paper, we attempt to improve their production through screening the high nemadectin-producing strains and optimizing of th
7、e fermentation conditions and put to use in production large scale having provided the reliable technological parameter. First, through purification，a stable yield strain was obtained. Based on the biosynthetic pathway and metabolic regulation of Streptomyces cyaneogriseus subspecies noncyanogenus,
8、sodium acetate, valine, valinehudroxamate and 2-deoxy-D-glucose chose as screening agents, a rational selection procedure with UV mutation was performed to obtain a higher nemadectin-producing strain. Finally a high producing strain N-09-20 was obtained and produced 77 mg/L nemadectin, which was fou
9、r times higher than the original strain. Then the strain N-09-20 was treated with UV and streptomycin, after self-metabolic regulation for 4 times, the production of N-16-19 was 172 mg/L, 10 times higher than N-01-31. Subculture test indicated that the hereditary character of strain N-16-19 was of s
10、tability. The optimization of the fermentation progress for higher nemadectin-producing strain N-16-19 was studied. On the optimal fermentation medium, the production of N-16-19 is 236 mg/L, which was 67% higher than primary medium. At the same time, the effects of strain age, inoculums, seed age, i
11、noculum level, temperature and dissolved oxygen on nemadectin fermentation were studied in the shaking flasks. Short-chain fatty acid precursor and amine acid precursor were invested in fermentation, additional time and additional volumes were determined. Furthermore, the tablism of nemadecctin incl
12、uding living things amounts, pH value, general sugar contents, deoxidize sugar and amino nitrogen contents were studies during the fermentation. These messages would be useful for large scale production. Key words: nemadectin; rational screening; sodium acetate; valine; valine hudroxamate; 2-deoxy-D
13、-glucose; streptomycin Candidate:Wang Ze Speciality: Biochemistry and Molecular Biology Supervisor: Wang Xiang-jing 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独 创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 （注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在
14、论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解 密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名： 日期： 年 月 日 引 言 1 1 引言 1.1 生物农药与尼莫克汀 生物农药是指利用生物活体或其代谢产物对害虫、病菌、杂草、线虫、鼠类
15、等有害生物 进行防治的一类农药制剂，或者是通过仿生合成具有特异作用的农药制剂。我国是最早应用 杀虫剂、 杀菌剂防治植物病虫害的国家之一， 早在 1800 年前就已应用了汞剂、 砷剂和藜芦等。 直到 20 世纪 40 年代初，植物性农药和无机农药仍是防治病害虫的有利武器。20 世纪 40 年 代发明有机化学农药之后，极大地增强了人类控制病虫危害的能力，为我们挽回农作物产量 损失作出了重大的贡献。但是，长期依赖和大量使用有机合成化学农药，已经带来了众所周 知的环境污染、生态平衡破坏和食品安全等一系列问题，对推动农业经济实现持续发展带来 许多不利的影响。生物农药与化学农药相比，其有效成分来源，工业化
16、生产途径，产品的杀 虫防病机理和作用方式等诸多方面，有着许多本质的区别。生物农药更适合于扩大在未来有 害生物综合治理策略中的应用比重（沈寅初，2000；魏艳敏，2007；吴文君等，2004） 。 我国微生物资源丰富，发展生物农药的条件得天独厚。近年来，我国开发的生物农药及 其它农药技术已得到国际农药界的关注。优先发展生物农药，并以生物农药带动其它高科技 农药的全面发展，将成为我国农药产业发展的方向。随着科学技术的发展，我国已有苏云金 芽孢杆菌、春雷霉素、井冈霉素、公主岭霉素等生物农药实用化的商品。随着对生物农药研 究的深入，将有更多的品种实用化，投入市场，在农业领域中应用。目前传统生物农药已经 产业化，基因工程农药进入商品化，遗传工程作物已经接近实现。 尼莫克汀 （Nemadectin） 由蓝灰链霉菌 Streptomyces cyaneogriseus sp. noncyanogenus 发酵 产生，是十六元大环内酯化合物，属于米尔贝霉素族（Milbemycin）抗生素。以尼莫克汀为 基础半化学合
