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1、东北农业大学 硕士学位论文 兔产气荚膜梭菌（A型）毒素原核表达产物免疫原性分析 姓名：刘家森 申请学位级别：硕士 专业：预防兽医学 指导教师：李一经;陈洪岩 20040601 摘要 兔产气荚膜梭菌病( 甜o s 打j 以p e r f r i n g e n sd i s e a s e ) 是由A 型产气荚膜梭菌 ( C 1 0 s t r i d i u m p e r f r i n g e n s ) 引起的兔的一种消化道传染病，各年龄、各品种兔均可发 病，以幼兔和青年兔发病率最高，死亡率可达1 0 0 ，严重危害养兔业的发展。对于该 病主要致病因子。毒素的研究具有重要意义。 本实验从
2、A 型产气荚膜梭菌( N J 株) 的总D N A 中，通过P C R 扩增出n 毒素全基因， 构建克隆载体p M D l 8 T Ca 。测序结果显示A 型产气荚膜梭菌( N J 株) 的毒素基因全长 1 1 9 4 b p ，含有完整的开放阅读框，编码3 9 8 个氨基酸，其中前2 8 a a 为信号肽，后3 7 0 a a 构成成熟的n 毒素。将核苷酸序列与G e n e B a n k 中已发表的菌株N C I B l 9 6 8 1 ( t y p e B ) 、 N C I B l 0 6 6 2 ( t y p e C ) 和L 9 ( t y p e d ) 的a 毒素基因序列
3、进行比对，同源性达到9 9 2 7 。将 a 毒素全基因从克隆载体p M D l 8 T Ca 亚克隆到表达载体p P R O - E XH T b 中，构建表达载体 p P R O I i T b C ，并在大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 ) 中进行了诱导表达研究。 将毒素基因部分序列从克隆载体p M D l 8 T CQ 分别亚克隆到表达载体p P R O E xH T a 和p E T - 3 0 b 中，获得重组表达载体p P R O H T a PQ 和p E T 3 0 b P a ，并在大肠杆菌B L 2 1 5 0 、“”表示 2 5 、“+ ”表示 3 ，“”表示该项
4、未测 进一步的研究表明，a 毒素的存在形式有两种：一种是活性位点易接近的敞开形式 另一种是1 3 5 1 5 0 残基被自身的环状结构包裹的封闭形式。在C 末端与脂膜结合后，日 6 + + +卅 + + + + + 十 + + + 十+ + + + + 十H H + + + + + + + + + + + + + + + + 卅 S S S G I S G S G A S G L D Q G L I 。n鹋船H m瞄；墨l曼m m m m量；耋|耋|妣讲H蜷思撇鬻燃鬻篇糍 起封闭结构的翻转，暴露出活性位点，水解磷脂底物( N a y l o rC E ，1 9 9 9 ) 。 1 1 3 6Q
5、 毒素的免疫原性 a 毒素晶体结构的研究为进一步深入研究其免疫原性打下了坚实的基础。 W i l l i a m s o n 等( 1 9 9 3 ) 分别重组表达了a 毒素的N 末端( 一n ) 和C 末端( 国一m ) ， 免疫原性分析结果表明C p a ，m 免疫小鼠后产生的抗体能中和a 毒素的磷脂酶C 活性，但 不能中和n 毒素的溶血活性。C p a 。一m 免疫小鼠后产生的抗体既能中和d 毒素的磷脂酶C 活性，又能中和a 毒素的溶血活性，同时能抵抗致死剂量的a 毒素的攻击和至少1 0 倍致 死剂量的A 型产气荚膜梭菌攻击。由于C 末端与a 毒素和细胞膜的结合有关，故C 末端 表达产物
6、单独免疫小鼠，产生的抗血清可以中和a 全毒素，使其失去与细胞膜的结合能 力进而丧失溶血活性和致死活性。 许崇波等( 1 9 9 8 ) ，利用重组缺失技术，克隆了毒素6 8 位组氨酸残基后9 5 0 b p 的 基因片段，表达的重组蛋白作为抗原免疫小鼠用2 倍致死剂量进行攻击，保护率可达 到9 4 ，其认为H i s * 残基的缺失可以导致a 毒素生物活性的缺失，仍可提供较好的免 疫原性。 1 1 3 7a 毒素的检测 传统的a 毒素的检测方法有动物致死性实验、卵磷脂水解实验、毒素抗毒素中和实 验等。现在较普遍运用的有P C R ( 聚合酶链式反应) 及E L I S A ( 酶联免疫实验)
7、等方法。 F a c h 等( 1 9 9 3 ) 报道应用P C R 检测Q 毒素，以D N A 作为模扳时，其检出的极限可达 2 5 0 n g 2 5 f g ，对粪便样品中的细菌进行检测，敏感度可达2 9 5Xi 0 8 个菌细胞g ，当用 套式P c R 检测时，对细菌的检测极限达到1 6 个细菌细胞。文其乙等( 2 0 0 2 ) 用P C R 的方 法对猝死梅花鹿、山羊、腹泻猪的粪便，进行检擦i 及细菌定性分析，同时可确定病原菌 所属基因型，灵敏度达到1 0 1 0 4 C F U g 。P C R 诊断周期短，操作简便其特异性和敏感 性均优于经典的方法，尤其适用于动物死亡过久导
8、致体内毒素的失活，不会造成漏检。 P C R 有可能成为产气荚膜梭菌鉴定和分型的酋选工具。 H a l e 等( 1 9 9 9 ) 以鼠源单克隆抗体4 F 2 作为捕获抗体，建立了捕获抗体E L I S A 方法， 可以准确特异检测到a 毒素，检出极限为1 9 n g m l 。N a y l o r 等( 1 9 9 7 ) 运用E L I S A 的方法， 从死亡动物肠内容物的培养上清中检测a 毒素，其极限可达到2 5 n g m l 的水平。张存帅 等( 2 0 0 0 ) 先后建立了D o t - - E L I S A 的方法，对产气荚膜梭菌毒素进行检测。这些都说明 E L I S
9、 A 方法是一种较为简便、快捷、敏感的检测方法。 1 2 兔产气荚膜梭菌病临床发病特征 1 2 1 发病原因 产气荚膜梭菌广泛存在于土壤、污水、粪便、低质饲料及人畜肠道内。该菌为条件 致病菌在正常情况下不致病，许多诱发因素如长途运输、饲养管理不当，青饲料短缺 粗纤维含量低，饲料突然变换，饲喂高蛋白成分的精料，饲喂劣质鱼粉，长期饲喂抗生 素或磺胺类药物，气候骤变等均可促使家兔肠道内环境发生改变，肠道正常菌群遭到 7 破坏，使该菌大量繁殖、产生毒素，兔中毒死亡。 1 2 2 流行特点 本病多里爆发性或地方性流行，来势凶猛，传播很快，发病急剧，死亡迅速。流行 初期仅个别兔死亡，接着就出现大批病兔。病
10、菌感染途径为消化道传染、皮肤和粘膜损 伤等，病兔、带菌兔及其排泄物是主要传染来源，含有该病菌的土壤、饮水也是传染源。 一年四季均可发生，以春、秋、冬3 季多发。本病的暴发除哺乳仔兔外，不同年龄、品 种、性别的家兔对本菌均有易感性，以幼兔和青年兔发病率最高，毛用兔、尤其是纯种 毛兔和獭兔最易发病。 1 2 3 临床症状和病理变化 本病显著症状为急剧下痢，临死前水泻。出现水泻前精神和食欲无明显变化：出现 水泻后，精神沉郁，不吃食；粪便不成形，很快变成带血色、胶胨样、黑色或褐色、腥 臭味稀粪，污染臀部及后腿。患兔四肢无力，呈现昏迷状态，逐渐死亡。有的病兔死前 出现抽搐，个别突然兴奋，尖叫一声，倒地而
11、死。绝大多数病兔属于最急性型，在出现 水泻的当天或次日即死亡，少数可拖延至一周或更久，但昂终仍死亡。 兔尸多数营养状况良好，毛色正常，眼球突出，口角周围被毛被唾液润湿，肛门周 围有黑褐色粪便污染。剖检腹腔可嗅到特殊的腥臭味。胃内多充满食糜和气体，胃底部 黏膜脱落，可见有大小不一的溃疡；小肠多充满气体，致使肠壁薄而透明；盲肠和结肠 充满气体和黑绿色的稀薄内容物。肠壁有弥漫性出血或充血。肝脏质地变脆，脾呈深褐 色。肾、淋巴结多数无变化。膀胱内多数积有茶色尿液。心脏表面血管怒张，里树枝状。 1 3 兔产气荚膜梭茵病的实验室诊断和防治措施 根据流行稍学、临床症状和剖检病变等主要特点，可以作出初步诊断但
12、确诊仍需 通过实验室进行微生物诊断。 1 3 1 常规诊断 取病死兔空肠、回肠和盲肠内容物涂片，革兰氏染色镜检。可看到很多革兰氏阳性 大杆菌，呈单个或成对存在，菌端圆整；部分菌有芽孢，位于菌体的中央或亚中央。骆 氏美蓝荚膜染色可见到染成红色的荚膜。接种肉汤培养基，3 7 “ C 培养5 6 h 后培养基变 混浊，并产生大量气体，将此培养液接种于血液琼脂平板，3 7 “ C 厌氧培养2 4 小时，形成 有双溶血环的圆形、表面光滑、边缘整齐的灰白色菌落。取该菌落涂片，革兰氏染色镜 检，为两端钝圆、有荚膜的革兰氏阳性大杆菌。本菌可使葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露 糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、淀粉、糖原和肌醇
13、发酵产酸产气能还原硫酸亚铁。产生硫 化氢。本菌能液化明胶，接种牛乳培养基呈汹涌发酵反应。将肉汤培养物经腹腔注射， 小鼠注射0 0 2 m 1 后于2 4 小时死亡，家兔注射0 5 m l 后于2 4 小时死亡，病变与自然发病 者相同。最后可用定型血清进行毒素中和试验将细菌定型( 王云峰等，1 9 9 9 ) 。 1 3 2 染色荧光诊断 产气荚膜梭菌产生的磷酸酶可以水解4 一甲基伞形酮酰磷酸盐 ( 4 - m e t h y l u m b e l l i f e r y lp h o s p h a t e ，删P ) 产生荧光物质4 一甲基伞形酮 ( 4 - m e t h y l u m
14、 b e l l i f e r o n e ) ，在3 6 5 n m 紫外光下可以检测荧光强度；同时产气荚膜梭菌在 水解乳糖时会产生B 一半乳糖苷酶，此酶水解邻硝基苯酚B D - 半乳糖苷( o - n it r o p h e n y l B D - g a l a c t o p y r a n o s i d e ，O P N G ) 为邻硝基苯酚呈黄色。利用含有m J P 和O N P G 的诊断试 剂可以特异的证实产气荚膜梭菌的存在，并可在4 小时内获得结果( P h l i p 等2 0 0 1 ) 。 1 3 3 分子生物学诊断 P C R 诊断：P C R 诊断具有周期短。
15、操作简便等优点，且特异性和敏感性均优予经典的 方法，以D N A 作为模板时，其检出的极限可达2 5 0 n g 2 5 f g ，对粪便样品中的细菌进行检 测。敏感度可达2 9 5 X1 0 9 个菌细胞g ；当用套式P G R 检测时，对细菌的检测极限达到1 6 个细菌细胞。对大肠杆菌、艰难援菌、双歧杆菌、金黄色葡萄球菌等其他潜在菌均无 特异扩增区带。R A P D 技术：不同血清型的产气荚膜梭菌其R A P D 指纹图谱不同，采用随机 扩增多态性DNA ( R a n d o m l yA m p l i f i e dP o l y m o r p h i cD N A ，R A P
16、D ) 技术对产气荚膜梭菌 进行P C R 扩增，产气荚膜梭菌A 、B 、C 、D4 个型之间的条带差别明显( 杨明凡等，2 0 0 0 ) 。 可以用于产气荚膜梭菌鉴定分型，也可用此方法确定某地区某一微生物的感染情况及其 感染源发现新的流行菌株，以便及时采取有效地防治措施。E L I S A 诊断：根据产气荚膜 梭苗可以产生a 毒素，分别建立的捕获抗体E L I S A 方法、间接E L I S A 和D O T - - E L I S A 方法， 检出极限可以达到1 9 n g m l 、2 5 n g m l 和0 0 0 1 M L D , 其中D O T - - E L I S A 方法更适用于现地 应用，E L I S A 还可以鉴定产气荚膜梭菌的型别( 柴同杰等，2 0 0 1 ) 。 1 3 4 防治措施 目前针对该病使用的疫苗主要有：兔产气荚膜梭菌( A 型) 病氢氧化铝灭活苗兔 产气
