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1、河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 躲俪帅雠：璐一一黼囹 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名：1 可狈 导师签章： 土) ，压 1、r 1 1 年多月7 多日 目录 | I I I IIII lll lI I I II II IIIl Y 19 0 0 3 8 7 中文摘要1 英文摘要4 研究论文人牙周成纤维细胞诱导形成结合上皮样细胞的研究 前言” 日 I 舌 材料与方法7 结果1
2、0 附图1 2 讨论2 8 结j 沦3 0 参考文献3 1 综述牙周膜组织的干细胞3 3 致谢4 0 个人简历4 1 中文摘要 人牙周成纤维细胞诱导形成结合上皮样细胞的研究 摘要 目的： 口腔结合上皮( j u n c t i o n a le p i t h e l i u m ，J E ) 是附着在牙颈部连接结缔组 织与牙面的特殊上皮结构，形成龈牙结合部。结合上皮来自于缩余釉上 皮，是一种无角化无钉突的上皮组织，也是口腔生理上的一个薄弱环节。 在牙周炎发生时，结合上皮首先被破坏，是牙周炎的始发部位。由于结合 上皮的摧毁，导致牙周袋形成和牙槽骨吸收，牙周炎进入进展期和活动期， 成为严重破坏口
3、腔咀嚼功能的疾病。当牙周炎静止后，结合上皮所构成的 龈牙结合修复缓慢，正常牙周结构重建困难。因此，研究结合上皮的再 生和诱导是研究牙周炎治疗后牙周功能结构重建的难点和重点。本研究拟 通过对人牙周成纤维细胞的体外培养，诱导形成结合上皮样细胞，生长在 脱细胞真皮基质( a c e l l u l a rd e r m a lm a t r i x ，A D M ) 支架和小肠黏膜下层 ( s m a l li n t e s t i n a ls u b m u c o s a ，S I S ) 支架组织上，探讨诱导形成的结合上皮 样细胞及其形成的组织结构，为龈牙结合部的形成提供上皮细胞来源的 理
4、论依据和实验室数据。 牙周膜又称牙周韧带( P e r i o d o n t a ll i g a m e n t ) ，是牙根与牙槽骨之间的 一层结缔组织，是重要的牙周支持组织，主要由成纤维细胞组成。许多研 究已证明牙周成纤维细胞具有干细胞的特性f 1 卅。正常情况下，牙周组织 具有极强的修复能力，其修复活动是通过牙周膜中的不同细胞亚群的定向 迁移和分化实现的【5 6 】。本实验拟采用牙周成纤维细胞，诱导成为上皮样 细胞，揭示牙周成纤维细胞具备多向分化的干细胞特征。 随着组织工程技术的发展，选择适合的支架材料是组织工程研究的又 一重要内容。目前，常用的支架材料有猪小肠粘膜下层支架、引导组织
5、再 生胶原膜、脱细胞真皮基质，纳米羟基磷灰石等。这些材料多具有良好的 生物相容性、多孔性结构和高孔隙率及生物可降解性【7 1 。本实验选用脱细 胞真皮基质( a c e l l u l a rd e r m a lm a t r i x ，A D M ) 和小肠黏膜下层( s m a l l i n t e s t i n a ls u b m u c o s a ，S I S ) 两种支架材料作为结合上皮样细胞附着的支架 组织，探讨结合上皮样细胞对支架组织的附着能力及相容性，并探讨结合 上皮样细胞在支架组织上生长的免疫特性和超微结构。 中文摘要 方法： 1 人牙周成纤维细胞的培养和鉴定收集河
6、北医大口腔医院正畸拔 除的健康完整双尖牙( 患者1 2 3 0 岁) ，刮下其根中1 3 牙周膜组织。采 用组织块培养法，培养液选用含2 0 胎牛血清的低糖D M E M ，O 2 5 胰酶 消化，传代至第3 代，采用抗波形蛋白v i m e n t i n 和抗细胞角蛋白C K 的免 疫细胞化学进行细胞鉴定。 2 人牙周成纤维细胞的诱导培养采用K S F M 培养液，对第3 代人 牙周成细胞进行诱导培养7 1 0 天，采用抗波形蛋白v i m e n t i n 和抗细胞角 蛋白C K 的免疫细胞化学进行细胞鉴定。 3 小肠黏膜下层( s m a l li n t e s t i n a l
7、s u b m u c o s a ，S I S ) 支架组织的制备 留取猪空肠组织5 0c m ，去除其浆膜层和肌层，在含有双抗( 青霉素、 链霉素) 的P B S 溶液中浸泡3h ；O 2 5 胰酶中浸泡2 4h ；双蒸水漂洗， 0 5 S D S2 4h ；双蒸水漂洗。在含O 1 过氧乙酸的2 0 乙醇溶液中浸 泡1 0h ，双蒸水漂洗；冻干后环氧乙烷消毒备用。 4 人牙周成纤维细胞接种及诱导培养将人牙周成纤维细胞分别接 种到小肠黏膜下层( s m a l li n t e s t i n a ls u b m u c o s a ，S I S ) 和脱细胞真皮基质 ( a c e l
8、l u l a rd e r m a lm a t r i x ，A D M ) 上，K - S F M 诱导培养3 5 天。石蜡包埋， 组织切片角蛋白C K 免疫组织化学染色。扫描电镜观察细胞在支架上的生 长状态。 结果： 1 原代培养及其鉴定牙周组织原代培养7 1 0 天，细胞爬出，获得 的成纤维细胞呈梭形、胞体大，核大，圆形或椭圆形，有1 3 个核仁。采 用第3 代细胞进行免疫细胞化学染色鉴定，成纤维细胞对抗波形蛋白 v i m e n t i n 呈阳性反应，抗角蛋白C K 阴性反应。 2 人牙周成纤维细胞诱导及鉴定经K S F M 诱导后细胞爬片，免疫 细胞化学染色，抗角蛋白C K
9、阳性表达，表明牙周成纤维细胞诱导培养后， 具备上皮细胞的免疫特性。 3 小肠黏膜下层( s m a l li n t e s t i n a ls u b m u c o s a ，S I S ) 支架组织的电镜观 察制备所得S I S 经扫描电镜观察为无细胞的胶原束。 4 人牙周成纤维细胞接种及诱导培养牙周成纤维细胞在支架组织 上诱导培养后，石蜡包埋切片，免疫组织化学染色，抗角蛋白C K 阳性表 达 扁 英文摘要 S t u d yo fH u m a nP e r i o d o n t a lF i b r o b l a s t sI n d u c e di n t o J u n
10、c t i o n a lE p i t h e l i u m - L i k eC e l l s A B S T R C T o b j e c t i v e ：A sas p e c i a le p i t h e l i a ls t r u c t u r e ，j u n c t i o n a le p i t h e l i u m ( J E ) a t t a c h e st od e n t a lc e r v i x ，i tc o n n e c t e sc o n n e c t i v et i s s u e sw i t ht h et o o t
11、 hs u r f a c e a n df o r m sd e n t o - g i n g i v a lj u n c t i o n J Ed e r i v e df r o mr e d u c e dd e n t a le p i t h e l i u m h a sn os t r a t u mc o r n e u ma n de p i t h e l i u mp e g s D u et ot h ew e a k n e s so f p h y s i o l o g y , J Ew a sd e s t r o y e da t f i r s tw
12、h e np e r i o d e n t i t i so c c u r r e d ，w h i c h l e a d e dt op e r i o d o n a lp o c k e tf o r m e da n da l v e o l a rb o n er e s o r b e d A sar e s u l t , p e r i o d o n t i t i sd e v e l o p e dq u i c k l ya n da c t i v e l y , w h i c hm a d et h es e r i o u sl o s so f c h
13、e w i n gf u n c t i o n H o w e v e r , t h er e p a i ro fd e n t o g i n g i v a lj u n c t i o nw a sv e r y s l o w l ye v e na f t e rt h el e s i o n sr e p a i r e d ，r e c o n s t r u c t i o no fJ Es t r u c t u r ew a s d i f f i c u l t S o ，i ti st h ek e ya n de m p h a s i si nr e g e
14、 n e r a t i o no fJ Ef o rr e b u i l d i n g p e r i o d o n t a lf u n c t i o n a ls t r u c t u r e T h i sw a st os t u d yt h em o r p h o l o g i c a la n d i m m u n o h i s t o m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h ej u n c t i o n a l e p i t h e l i u m - l i k ec e l l s ， w h i
15、c hw a si n d u c e db yh u m a np e r i d o n t a lf i b r o b l a s t s ，a n dg r e wo na c e l l u l a r d e r m a lm a t r i x ( A D M ) a n ds m a l li n t e s t i n a ls u b m u c o s a ( S I S ) s c a f f o l d s T h e r e s u l t sc o u l dp r o v i d et h e o r yb a s i sa n dl a b o r a t o r yd a t ao fe p i t h e l i u ms o u r c eo f d e n t o - g i n g i v a lj u n c t
