微生物学-5生长讲解

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1、第五章 微生物的生长 及控制,个体生长微生物细胞的重量和体积不断增大的过程。 个体繁殖微生物细胞产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。 群体生长群体中个体数目和重量的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖,生长与繁殖的概念,单个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。,对于微生物，由于其主要进行无性f繁殖，故纯培养即为克隆。 建立纯培养，证实其纯度无可置疑并保 持不受污染是微生物学家最重要的任 务之一。,纯培养（pure culture）：,第一节 微生物的纯培养,用固体培养基分离纯培养,用液体培养基分离纯培养,单孢子或单细胞分离法,利用选择性

2、培养基分离法,一、用固体培养基分离纯培养（菌落分离法） 1.平板划线分离法,用接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线 ，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）,分段划线和连续划线,2.稀释倒平板法 3.涂布平板法,简单易行，但易造成机械损伤,涂布平板法,连续稀释,目的是使一支试管中分配不到一个微生物。 适合于优势微生物.,二、用液体培养基分离纯培养（液体稀释法）,三、单孢子或单细胞分离法,采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进

3、行培养以获得纯培养 。,在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。,四、选择性培养基分离法,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,利用选择培养基进行直接分离 富集培养,微生物纯培养分离方法的比较,第二节 微生物生长的测定,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；,客观地反映微生物生长的规律；,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；,微生物生长,微生物生长测量方法,计 数

4、 法,重 量 法,生理指标法,一、计数法,1 直接法 （全数法） 1）血球板法,优点：快捷、简便 缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 用于单细胞微生物,血球计数板法,原理：将1cm20.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。,血球计数板法,2）比浊法,在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比。,特点：快速、简便；但易受干扰。,2 间接法（活菌计数法） 1）,2）薄膜过滤计数法,测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。 将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜

5、上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,二、重量法,总氮测定法,测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法,直接法,干重,湿重,间接法,DNA含量测定法,三、生理指标测定法,样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显， 因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量 热计等设备来测定相应的指标。,常用于对微生物的快速鉴定与检测,微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、 生物热等与其群体的规模成正相关。,第三节 微生物的生长规律,一、细菌群体生长规律 （典型生长曲线） 两个定义,生长曲线,分批培养,分批培养：指微生物在一定容积的培养基中，在特定培养条 件下只完成一个生长循

6、环（最后一次收获）的培 养方法。（封闭系统） 连续培养：指微生物在整个生长时间，以一定的方法（恒浊、 恒化）使微生物持续的以较恒定的生长速率生长 的培养方法。（开放系统）,生长曲线：,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样，测菌量。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,细菌纯培养群体生长测定,根据微生物生长速率常数（每小时的分裂代数）的不同，可分为迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期。,生长曲线可分：,延迟期,对数期,衰亡期,稳定期,其它名称：停滞期、调整期 现象：曲线平行于横轴 特点： 生长速率常数= 0 形态变大 合成代谢活

7、跃 （核糖体、酶类、ATP合成加快） 对不良条件敏感 （如氯化钠、温度、抗生素等） 原因：适应环境，调整代谢,1 延迟期,菌种 ： 繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短 接种物菌龄 ： 用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期； 接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）； 培养基成分： 在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短； 接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,影响延迟期长短的因素：,对实践的指导意义：,在发酵工业上需尽量缩短延迟期； 增

8、加接种量； （群体优势-适应性增强） 采用对数期的菌种； 调整培养基 在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,2 对数期,其他名称：指数期 现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。 特点： 生长速率常数最大，即代时最短 细胞进行平衡生长 （菌体大小、形态、生理特征等比较一致） 代谢最旺盛 对理化因素较敏感 影响因素：菌种；营养成分；营养物浓度培养温度,应用意义： 生产上用作接种的最佳菌龄； 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 是生理研究或进行染色、形态观察等的良好材料,3 稳定期,又称：恒定期或最高生长期 特点： 生长速率处于动态

9、平衡。 分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。 开始合成次生代谢产物。 产生原因： 营养物耗尽 营养物比例失调 代谢废物的积累 （酸、醇、毒素等） 物化条件不合适 （pH、氧化还原势等）,应用意义： 发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下： 补充营养物质（补料） 调pH 调整温度,4 衰亡期,特点： 出现“负生长”。 细胞内颗粒更明显，细胞出现畸形或衰退形，芽孢释放。 产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,二、同步培养,1.概念,同步培养(synchronous culture)：是

10、一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。,同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式,同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。,同步培养方法,机械方法,环境条件控制技术,离心方法,过滤分离法,硝酸纤维素滤膜法,温度,培养基成份控制,光照和黑暗交替培养,硝酸纤维素滤膜法,离心法,三、连续培养,连续培养(continous culture of microorganisms)是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种

11、培养方法。,连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物,连续培养类型,恒浊连续培养,恒化连续培养,无菌培养基储备器,控制系统,培养装置,收集器,通气、搅拌装置,(一)恒化连续培养,在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定（低）的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。,生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质,恒化器连续培养通常用于微生物学的研究工作，如筛选不同的变种、模拟自然条件等。,生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制

12、因子,(二)恒浊连续培养,通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。,用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业,(三)连续发酵与单批发酵相比,优点：缩短发酵周期，提高设备利用率； 便于自动控制； 降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定；,缺点：杂菌污染和菌种退化,第四节 环境因素对微生物的影响,影响因素：,氧,温 度,PH 值,影响表现： 影响酶活性 影响细胞膜的流动性 影响物质的溶解度,一、温度,（一）微生物生长的三个温度基点,最低生长温度：微生物生长的最低温度下限；最高生长温度：微生物生长的最高温度； 最适生长温度：微生物生长最

13、快时的温度 1）最适温度不等于积累代谢产物的最佳温度； 2）同类型发酵使用菌种不同，最适温度不同； 3）同一微生物不同生理活动的最适温度不同。,根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：,（二）微生物生长温度类型,低温型微生物（嗜冷微生物） 中温型微生物（嗜温微生物） 高温型微生物（嗜热微生物）,应用,低温：速冻加保护剂，用于菌种保藏 干热法 高温用于消毒灭菌 湿热法,理化因素的影响温度,微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群: 专性好氧菌: 好氧菌 微好氧菌： 兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌： 厌氧菌 (专性)厌氧菌：,二、氧气,氧浓

14、度对不同微生物生长的影响,在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（ O2 ）等。超氧阴离子为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。 好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等。 而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。,厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说：,各类菌所含对氧解毒酶,专性好氧菌 SOD，过氧化氢酶 兼性厌氧菌 SOD， 过氧化氢酶 专性厌氧菌 二种酶均无 微好氧菌 少量SOD 耐氧菌 SOD， 过氧化物酶,影响

15、膜表面电荷的性质及膜的通透性 改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径 如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在 pH6.5以上产甘油、酸。 影响培养基中营养物质的离子化程度,三、pH,（一）影响表现：,微生物生长的pH值三基点： 各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。,（二) 不同微生物对pH要求不同,（三）微生物的生命活动对环境pH值的影响,微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变： 由于有机物分解： 分解糖类、脂肪等，产生酸性物质，使培养液pH值下降； 分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上升 由于无机盐选择性吸收： 铵盐吸收（(NH4)2SO4 H2SO4）， pH 硝酸盐吸收(NaNO3 NaOH)， pH,培养过程中调节pH值的措施 过酸时：加入碱或适量氮源，提高通气量。 过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量。,NH4+被吸收,NO3+被吸收,配制培养基时调整pH值的措施：,第五节 微生物生长繁殖的控制,一 基本概念,防腐(antisepsis)：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施,消毒(disinfection)：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施,灭菌(sterilization)：指利用某种方法杀