《农杆菌介导的菊花遗传转化和ipt基因导入》由会员分享，可在线阅读，更多相关《农杆菌介导的菊花遗传转化和ipt基因导入（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、农杆菌介导的菊花遗传转化和i p t 基因导人 李名扬兄岳恩郑 丽 西南农业大学园艺因 林学院，中国 . 重庆 4 0 0 7 1 6 ) 摘 要:通过大 1再生 试验选 择了 山城之光和日 本小 黄两个品种作为遗传转化的材料( 山 城 之光为 切花菊，日 本小 黄为小 菊) .所选用的外源 墓因为 抑制叶片衰老的S A G 一 工 P T 基因，以 期 得到衬贮运、 别 凡 播 寿命长的切花菊和抗衰老、花期长的绿化小菊. 工 、 建立了以 幼叶和茎段为外植体的 再生体系 取 植 株 冈 碾开 的 幼 叶 或 幼 茎， 消 毒 后 接 人M S l ( M S O + I .O M 昨 2 ,
2、4 D + O . I m g / f . 6 -B A ) 中 预 培 养2 - 6 d 后 ， 转 人M S 2 ( M S O + 0 .5 m 叨6 -B A + O . l m g / L N A A ) ( 幼叶) 、 M S 3 ( M S 0 + 3 .O m g/ 1 bB A + 0 . l m g / L N A A ) ( 茎 段) 后 可 直 接 再生出 芽. 其中， 菊花品 种山 城之光和日 本小 黄的幼时 经预培养 后再生率可达1 0 0 % .日 本小黄 茎段再生 率达 9 2 %， 山 城之光再生 率为7 0 % . 再 生芽在1 / 2 M S 培养基上经7
3、 - 1 0 d 可诱导生根， 生根率达1 0 0 % . 2 、 建立了以 幼叶为受体的遗传转化体系 取 切 花 菊“ 山 城 之 光” 和 ，/ l 有 “ 日 本 、 白 ” 的 无 菌苗 叶 片 ， 切 成4 m m ， 大 ，/ J 、以O D 6 o , :=0 .5 的 农 杆 菌 掖 感 染 3 0 m in , 渔除 菌液。 接人M s l 培养 基 上， 于暗 处 共培 养3 d 。 共培 养 后， 以 阴 加有5 0 0 m g / L 的C e f 和5 0 0 m 叭 的 C a cti 的M S O 液 味 材右 养 基 展 荡 脱 菌 培 养2 小 时无 菌 水
4、冲 洗5 次 无 菌 池 纸 洗 干 水 分然 后 接 人M S 2 + 5 0 m 叭 C e f 的 培养 荃上延 迟筛 选 培 养3 d ， 再 转 人M S 2 + 5 0 m g/ L C e f + 5 m g / L K m培养基 上 进行 筛 选分化培 养。 3 0 d 后可 分化 出 绿芽， 将 分 化的 绿 芽在1 / 2 M S O + 1 O m g/ L K m培 养 基上 进行生 根 筛选， 把能 够正 常 生 根的 苗 移 栽田 间州拓步一 步的 鉴定。 3 、 通 过P C R 扩 增 表明， 弥 渗 勺 有? J 3 的 植株 可以 检 点 1 出 有目 的
5、基因( i p t 基因) 的 存在， 目 的 基因 已 成 功 地 插人 菊花的基因 组中。园 艺性状观察表明， 转基因 植株和 “ 野生型” 植株存在有一定的 差异。 关.词:菊花: i t ) t 基因:遗传转化:植株再牛 菊花是原产于我国的 传 统十大 名花之一， 也是世界四 大鲜切花 之一，占 鲜切花总 量的2 3 % ， 其在世 界范围内 的 周年供应及流通具有十分重要的意义。 由于 菊花的 传统育种方 式是利 用芽变的方法来选育新品 种， 速度慢， 定向 性差 利用基因 工程技术， 有目 的 地向 菊花中导 人一些墓因， 来创造抗病性好、 观赏价 值高的 菊花新品 种， 不 但可
6、以 有目 的 地改良 特定性状， 还可以 缩短育种年限和 加快育种进程。 本文 通过大量的 再 生试 验选择了 两个品 种 ( 山 城之光和日 本小黄) 作为 遗传转化的 材料， 山 城之光 为切花菊，日 本小黄为 小菊。 所选用的外源基因 为抑制叶片 衰老的S A G - I P T基因，以 期得到耐心云 、 瓶插寿命长的切花菊山城之光和抗衰老、花期长的绿化小菊日 本小黄。 1 . 1 材料与方法 材料 1 . 1 . 1 植物材料 切花 菊山 城 之光、 白 绣 坊 白 雪、 光辉和 刁 铺 日 本 刁 、 黄 五 个品种 由 园 艺系 园 林 花 卉 教 研 室的 陈 老师 惠赠， 采自
7、 园艺系 花卉苗圃 1 7 6 1 . 1 .2 基本培养基 1 . 1 . 2 . 1 细菌培养基 L B培养基 B a c t o- t r y p t o n e l o g / L B a c t o- y e a s t e x ta c t 5 g 几 N a C l l o g / L p H 7 . 2 固体培养基加1 .5 - 2 % 的琼脂) YEB B a c t o- t r y p t o n e 5 g / L B a c t o- y e a s t e x t r a c t l g / L B e e f e x t r a c t 5 g / L Mg S
8、0 4 7 H 2 0 0 .4 3 9 g / L p H 7 乃 ( 固体培养基加人 L 5 - 2 % 的 琼脂) 1 . 1 .2 .2 植物培养墓 基本 培养基M S O : M S ( M ttr a s h ig e - S k o o k , 1 9 6 2 ) 矿质 元素 + M S 有机物+ 7 .5 g / L V j a + 3 0 g / L 蔗 糖,p H 5 .8 。 液 体培养 基不加潮旨 . 几种主要的培养基: 幼叶和 茎段 预培 养基M S I : M S O 十 1 .O tn 到 L 2 斗D + 0 .2 m g ( L B A 幼叶分化培 养基M S
9、 2 : M S O + 0 .5 m g / L B A + O . l m g / L N A A 生根培养基1 / 2 M S : MS O 培养基的 矿质元素和有机物成分减半 其他 培养基根据研究目 的的 不同 在以 上各种培养基中 再陡 肋 口 不同 种类与 浓度组合的激素和 抗生素。 1 .2实验方法 1 么1 培 养条件 所有 组织培 养 过程 若非特另 蜕 明， 都是 在2 4 - 2 6 C . 1 6 h 光照 如 h 黑暗 光 周期、 光强 度1 5 0 0 - 2 0 0 0 L x 的 培 养室中 进行。 农 杆菌在2 8 -C , 1 8 0 tp m的 恒温摇床上
10、培养。 1 .2 .2 无菌材料的 获得 选取盆栽菊花的 下部新萌发的 根雍苗， 取顶部0 .5 - l c m左右， 用自 来水冲 洗3 0 m i n ， 然后用7 0 % 的 乙醇消 毒l n ti n ， 无菌 水晰先 一次 再用0 . 且 % 的 升汞 灭菌8 二 左右，无菌水冲 洗5 - 6 次， 插到1 / 2 M S 上， 令其生长，既可获得无菌苗。 组织培养和遗传转化听 用的无菌叶片和茎段可直接从无菌苗上获得。 1 .2 3再生体系的建立 1 . 2 3 . 1幼叶再生体现的建立 取 山 城 之 光 无 菌 苗 的 叶 片 ， 切 成 tn m 2 划、 ， 接 人M S O
11、 + O . l m g llN A A + 0 . 1 . 0 .5 . 1 .0 , 2 .0 . 3 .0 , 4 .O m g /1B A 的 培养基中 分化培 养， 4 0 d 后统 计再生 频率。 1 .2 3 .2叶龄对再生的 影响 取山 城之光 上部花蕾部位的 老叶和根部新萌发的 脚芽 上的幼 嫩叶片， 用7 5 % 的 酒精、 升汞 灭菌后， 在M S 1 上预 培养2 d ， 再转人M S 2 中 分化， 4 0 d 后统计分 化率。 1 .2 3 3基因型对幼叶 再生的 影响 取山 城之光、 白 绣纺、白 雪、 光 辉和 小菊日 本小黄等 品 种的 无 菌 苗叶 片， 切
12、 成4 m u Z 大小 ， 接种于 ms t 培养基上预培养2 d . 然后转人MS 2 培养基上进行分化培养， 4 0 d 后统计个品 种的分化率。 1 7 7 1 .2 3 .4预培养对幼叶 再生的 影响 取山 城 之 光 和日 本 小 黄 无菌 苗 叶 片， 切 成4 m m 2 大小. 接 种于M S 1 培养 基 上培 养， 培 养时 间 设置 为 0 . 2 , 4 . 6 . 8 d 五个时间 梯度。 然 后转人M S 2 培 养基上 进 行分 化培 养， 4 0 d 后统 计分化 率。 1 .2 3 5茎 段再生体系的 建立 取日 本小黄无菌苗幼 茎， 切成2 m m左右的
13、不带腋芽的 茎段， 接种于M S 1 培养 基上培养2 d 。 然后转 入M S O + O . l m g / 1 N A A + O , 1 .0 . 2 .0 . 3 .0 . 4 .O m g /1 B A中， 4 0 d 后 统计分化 率。 1 .2 .4转化 方法和转化 条件的 优化 1 .2 .4 . 1 选择压及头抱霉素浓 度的确 定 1 .2 .4 . 1 .1 选择压的 确定 取 山 城 之 光 无 菌 苗 叶 片 ， 切 成4 m m 2 大 小， 接 种 于M S 1 培 养 基 上 培 养3 d 后， 分 别 转 人M S 2 + 0 . 1 , 5 . 1 0 .
14、2 0 . 3 0 . 5 0 . 7 0 m g / l K m的 培 养基中， 于3 0 d 后统计再生 率、 正常 芽 率及再生 芽的白 化情况。 1 .2 .4 . 1 .2 头 抱拐家( C e f ) 对再生的 影响 取 山 城 之 光无 菌 苗 叶 片 ， 切 成4 m m 2 大 小 接 种于M S 1 培 养 基 上 培 养2 d 后 ， 分 别 转 人M S 2 + 0 . 5 0 . 1 0 0 . 2 0 0 . 4 0 0 . 6 0 0 . 8 0 0 m 幼的培养基种分化培养， 于3 0 d 后统计再生率。 1 .2 .4 . 1 3卡 那 称素 对生 根的 影响
15、 取无菌 苗山 城之 光茎尖， 分别 接种于1 / 2 M S + 0 . 1 . 5 . 1 0 m g / l K m培 养基中， 1 5 d 后检 查生 根情况。 1 .2 .4 2农杆 菌的 培养与 括化 取出 一 :i 0; 下 保存的 农杆菌 菌 种P B S G 7 ， 划线 接种于黝A 有5 0 m 幼 K m . 1 2 5 m 幼S m的Y E B 培 养基 平 板上 在2 8 下 倒 置 培 养2 ( o 待 菌 落 长出 后 Y M一个 单 菌落 借重于5 m 1 附 加5 0 m g / lK m . 1 2 5 m g / 1S m 的Y E B 液 体 培 养 基
16、中 ， 1 8 0 t p m . 2 7 下置 于 摇 床上 震荡培 养 ， 进 行预活 化。 取2 5 - 5 0 u l 菌 液接种 于5 0 m 1 同 样 培养 基中 相同 条 件 下 培 养孙寸 数 生长 期。 取对 数 生长 期 菌 液室 温 下6 0 0 0 c p m离 心8 m in ， 去 上清 ， 以 M S O 液体培 养基重悬浮， 调O D 6 o o -0.5 ， 备用。 1 . 2 .4 3 转化方法 取无 菌 苗山 城之 光的 叶 片， 切 成4 m m 大小， 然后 浸人 备好的 农杆 菌菌 液 ( 加 人1 0 0 u m o ll l 的 乙 酸 丁 香酮) 中 感 染3 0 m i n ， 其间 不断 展荡使菌液与 外植体充分接触。 滤去菌液， 取出 外植体， 置于无菌滤纸 上 吸干多余的菌液， 转人 铺有滤纸的M S 1 培养基中， 叶片 背面朝向培养基，于暗中 培养3 d . 共 培 养 结 束 后， 将 外 植 体
