《农杆菌介导大豆胚尖转化体系的优化及sporamin和chitinase kdel转化后代分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《农杆菌介导大豆胚尖转化体系的优化及sporamin和chitinase kdel转化后代分析（73页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 分类号： S565.1 单位代码：10335 密 级： 学 号：20916030 硕 士 学 位 论 文 农杆菌介导大豆农杆菌介导大豆农杆菌介导大豆农杆菌介导大豆胚尖胚尖胚尖胚尖转化体系的优化及转化体系的优化及转化体系的优化及转化体系的优化及 Sporamin 和和和和 Chitinase KDEL 转化转化转化转化后代分析后代分析后代分析后代分析 申请人姓名： 卢 涛 指导教师： 唐 桂 香 副教授 专业名称： 作 物 学 研究方向： 作物逆境生理与调控 所在学院： 农业与生物技术学院 论文提交日期论文提交日期论文提交日期论文提交日期 2012 年年年年 02 月月月月 农杆菌介导大豆农杆
2、菌介导大豆农杆菌介导大豆农杆菌介导大豆胚尖胚尖胚尖胚尖转化体系的优化及转化体系的优化及转化体系的优化及转化体系的优化及Sporamin和和和和Chitinase KDEL 转化转化转化转化后代分析后代分析后代分析后代分析 论 文 评 阅 人： 论文答辩委员会主席： 论文答辩委员会成员： 论 文 答 辩 日 期： 二一二 年 三 月 Optimization of Agrobacterium-tumefaciens mediated soybean transformation system using embryo tips as explants and the analysis of Sp
3、oramin and Chitinase KDEL transgenic progeny A Dissertation Submitted to the Committee of Zhejiang University In Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Master of Agronomy Zhejiang University January 2012 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已
4、经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得 浙江大学浙江大学浙江大学浙江大学 或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 浙江大学浙江大学浙江大学浙江大学 有关保留、 使用学位论文的规定， 有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。 本人授权 浙江大学浙江大学浙江大学浙江大学 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
5、 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 本研究得到本研究得到本研究得到本研究得到： 农业部转基因生物新品种培育重大农业部转基因生物新品种培育重大农业部转基因生物新品种培育重大农业部转基因生物新品种培育重大（点点点点）专专专专项项项项 （2008ZX08004-004，2011ZX08004-009，2009ZX08010-013B） 资助资助资助资助 The project supported by The national major special project for transgenic organis
6、ms, Ministry of Agriculture in China （2008ZX08004-004,2011ZX08004-009,2009ZX08010-013B） 致致致致 谢谢谢谢 两年半的研究生生活即将结束，值此本论文完成之际，首先向我的导师唐 桂香副教授致以最诚挚的谢意。从刚入学时实验方法技能到实验设计实施再到 最后的论文编写修订，导师无不事必躬亲悉心指导。导师渊博的知识、严谨的 科学态度以及包容的精神深深影响着我，鼓舞着我前进。导师是我科研上的领 航者，也是生活中的良师。平日里，导师也给予我无微不至的关怀，帮我解决 生活上的困难。导师不仅传授我科研方法，还教会我做人做事的道
7、理。在此， 衷心感谢唐老师，谢谢您一直以来对我的付出。 同时感谢浙江大学生命科学学院寿惠霞教授，刚入学时寿老师为我提供了 良好的科研平台也为我硕士论文研究工作提供了便利的条件。在寿老师实验室 时，她对我提出了很多很好的建议，成为我人生之路的引导者。寿老师对科研 的严谨、对事业的执着追求、对学生的关怀深深地感动着我，让我受益终身。 感谢农学院作物所周伟军教授、程方民教授、汪自强教授、黄冲平副教授 等在科研上给我的帮助和指导，感谢农学院研究生科吴晓晶、马永芳、张帆老 师在学习生活上为我提供的帮助，在此对农学院的各位老师表示最诚挚的谢 意！ 感谢杨晓凤对我实验上的指导以及学习生活中的帮助，同时感谢我
8、的师妹 章杰琼、李红艳、胡小南同学以及温州医学院实习生吕碧珣师弟在实验上给我 的支持和帮助。在此还要向刘旦师兄、田甜、吴灵通、邓香芹、谭艳玲、吴冬 梅、刘光快、何会超以及王创师兄、黄炜师兄、周正剑、田璟鸾、王璐、马 林、李帅、周练、叶凌霄、付伟哲等同学表示感谢，因为你们使我的生活更加 丰富多彩。 最后，还要特别感谢我的父母，是您们的无私与支持使我走的更好；感谢 所有关心我的亲人，是你们给予我克服困难的决心和前进的动力！ 卢涛 2012 年 02 月于杭州紫金港 浙江大学硕士学位论文 I 目目目目 录录录录 致 谢. I 缩略图表.III 摘 要V ABSTRACTVII 1 文献综述.1 1.
9、1 引言.1 1.2 大豆遗传转化方法研究.2 1.3 农杆菌介导转化法在大豆中的应用.7 1.4 影响农杆菌介导大豆转化的因素.8 1.4.1 大豆基因型.9 1.4.2 大豆外植体.9 1.4.3 农杆菌菌株.11 1.4.4 Vir 基因的诱导11 1.4.5 抗氧化剂.12 1.4.6 培养条件的影响.13 1.4.7 选择标记.13 1.4.8 报告基因.14 1.5 转化后代的遗传分离.15 1.6 论文研究内容及意义.16 2 农杆菌介导大豆胚尖转化体系的优化研究.17 2.1 材料和方法.17 2.1.1 试验材料.17 2.1.2 质粒和菌株.17 2.1.3 培养基.18
10、2.1.4 农杆菌介导胚尖转化方法19 2.1.5 农杆菌介导大豆胚尖转化体系优化处理.20 2.1.6 GUS 瞬时表达分析21 2.2 结果与分析.21 浙江大学硕士学位论文 II 2.2.1 不同基因型对胚尖外植体 GUS 瞬时表达及芽诱导的影响.21 2.2.2 不同菌液浓度对农杆菌介导大豆胚尖转化 GUS 瞬时表达的影响23 2.2.3 不同侵染处理对农杆菌介导大豆胚尖转化 GUS 瞬时表达的影响24 2.2.4 不同植物激素配比对芽诱导的影响.24 2.2.5 液体培养.25 2.3 讨论.25 3 SPORAMIN 和 CHITINASE KDEL 转化后代鉴定和分析29 3.1
11、 引言.29 3.2 材料和方法.30 3.2.1 实验材料.30 3.2.2 转基因后代的鉴定.33 3.3 结果与分析.36 3.3.1 Sporamin 和 Chitinase KDEL 转化植株的鉴定36 3.3.2 Sporamin 和 Chitinase KDEL 转化 T1 代植株 RT-PCR 分析37 3.3.3 T1 代转基因大豆的鉴定38 3.3.4 Sporamin 和 Chitinase KDEL 转化植株遗传分析40 3.3.5 T2 代转基因大豆生育期记载表41 3.3.6 T1、T2 代转基因大豆考种表43 3.4 讨论.44 3.4.1 转化植株鉴定44 3.
12、4.2 转化植株遗传分析.45 4 结论和展望.47 参考文献：.49 附录 157 附录 258 浙江大学硕士学位论文 III 缩略图表缩略图表缩略图表缩略图表 缩写词缩写词缩写词缩写词 英文名称英文名称英文名称英文名称 中文名称中文名称中文名称中文名称 Ag+ Ag2S2O3 硫代硫酸银 AS Acetosyringone 乙酰丁香酮 Asp Asparagine 天冬氨酸 6-BA N6-Benzylaminopurine 苄氨基嘌呤 CCM Co-cultivation medium 共培养培养基 Cef Cefotaxime 头孢霉素 Cys Cysteine 半胱氨酸 DTT Di
13、thiothreitol 二硫苏糖醇 GA3 Gibberellic acid 赤霉酸 Glu Glutamine 谷氨酸 GM Germination medium 萌发培养基 GUS -Glucuronidase -葡(萄)糖苷酸酶 IAA Indole-3-acetic acid 吲哚乙酸 LA Lipoic acid -硫辛酸 LCCM Liquid co-cultivation medium 液体共培养培养基 LSI Liquid shoot induction medium 液体芽诱导培养基 MES 2-Morpholinoethane-sulfonic acid 2-(N-吗啉）
14、 乙烷磺酸 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 RM Rooting medium 生根培养基 SI Shoot induction 芽诱导 SIM Shoot induction medium 芽诱导培养基 T-DNA Transferred-DNA region 转移 DNA Tic Ticarcillin 替卡西林 WPM Woody plant medium 木本植物培养基 ZT Zeatin-R 玉米素 浙江大学硕士学位论文 IV 浙江大学硕士学位论文 V 摘摘摘摘 要要要要 大豆(Glycine max L.)是我国主要的粮食作物， 也是食用
15、油和植物蛋白质的主要 来源。从 1996 年起，我国大豆进出口形势发生了根本性的逆转，成为大豆净进口 国，其中绝大部分是转基因大豆及其产品。在耕地日益紧张，粮食安全问题日益 凸显的情况下，发展转基因技术显得尤为重要。但目前我国大豆转基因技术存在 转化效率低和实验重复性差的特点，如何提高大豆转化效率是转基因大豆产业化 迫切需要解决的问题。本论文主要通过大豆基因型、农杆菌菌液浓度、农杆菌侵 染方法、芽诱导阶段植物激素处理等因素优化大豆成熟胚尖为外植体的农杆菌介 导转化体系； 同时还研究了 Sporamin 和 Chitinase KDEL 大豆转基因后代的鉴定和 分离以及转基因植株农艺性状和产量的
16、分析。 以大豆成熟种子胚尖为外植体，以含有 GUS 报告基因和筛选标记 bar 基因的 pTF102 为载体，研究了不同基因型黑农 37、中豆 32、中黄 10、中黄 30、YC03-3 和 YC04-5 六个大豆栽培品种对农杆菌介导的 GUS 瞬时表达率和芽诱导的影响， 结果表明不同基因型表现为 GUS 瞬时表达率和芽诱导率最高的基因型为 YC03-3； 不同农杆菌菌液浓度（OD650 0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2）侵染大豆胚尖外植体表明 OD650为 0.6-0.8 共培养 3 d 后 GUS 瞬时表达率最高；常规侵染与超声波辅助侵染 相比，超声波辅助侵染有助于提高胚尖外植体的 GU
