《毕业论文--冷胁迫条件下不同玉米自交系miR398基因靶基因表达研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《毕业论文--冷胁迫条件下不同玉米自交系miR398基因靶基因表达研究（23页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、目 录中 文 摘 要IAbstractII第一章文献综述1第一节 低温冷害的类型及其影响1第二节miRNA研究价值22.1研究现状2第三节 miR398简介33.1 miR398的发现33.2 miR398的靶基因33.3 miR398与逆境胁迫3第四节qRT-PCR简介44.1技术方法简介44.2应用5第五节 本研究的目的和意义5第二章 冷胁迫条件下RNA提取检测7第一节 材料与方法71.1 试验材料71.2 试剂配制71.3 试验方法8第二节 实验结果10第三章 冷处理差异表达miR398及其靶基因的验证分析11第一节 材料与方法111.1 miR398 的 qRT-PCR111.2 靶基
2、因的 qRT-PCR12第二节 实验结果14第三节 结论15全 文 结 论16致 谢17参 考 文 献18中 文 摘 要玉米, 禾本科玉米属植物,为世界最主要的粮食作物和饲料作物，同时也是全世界总产量最高的农作物。我国玉米的主产区位于东北地区，同时玉米也是东北种植面积最大的作物。基于地理位置等因素，影响东北玉米产量最大的非生物胁迫是冷胁迫。所以，进行关于玉米冷响应机理的分析和研究非常必要。MicroRNA(miRNA)是由2124个核苷酸组成，由内源基因编码的非编码单链小分子RNA。miRNA对靶基因mRNA的作用方式主要有：一、切断靶基因的mRNA分子；二、抑制靶基因的翻译；三、结合抑制结合
3、以上两种形式。通过以上的方式对靶基因的表达水平负调控，参与到转录后基因的表达中去，借此对植物的生长发育进行调控, 同时当受到外界胁迫时，会通过改变表达进而调节植物体内的多种逆境胁迫应答。本研究通过对两个玉米自交系中miR398及其靶基因的表达情况进行比较分析，从而对miR398在植物受到冷胁迫下的表达调控进行研究分析。为阐释苗期玉米miR398调控的抗冷分子机理打下良好的基础。关键词：玉米；非生物胁迫；miR398；基因表达调控；胁迫应答；冷响应机制AbstractMaize ,one of the worlds three major food crops, its production o
4、n the worlds food supply has an important impact. Northeast China is the main producing area of maize in China, and it is one of the largest abalone crops. Cold stress is one of the main abiotic stresses to limit maize yield in Northeast China. Therefore, it is very important to study the mechanism
5、of cold response to maize. MicroRNA (miRNA) is a recently discovered small molecule RNA with a length of 21 to 24 nucleotides of non-coding proteins. It acts as a novel regulatory gene for the expression of small RNAs, which are involved in the regulation of plant growth and development by controlli
6、ng the expression of the target gene at the post-transcriptional level by transcription or translation of the target mRNA. Induced expression changes in the plant a variety of stress response to the process of play an important regulatory role.The miR398 gene expression in cold maize was studied by
7、comparing the miR398 gene in two maize inbred lines, which laid a good foundation for elucidating the molecular mechanism of miR398 regulation in maize.Keyword: Maize ; Abiotic stress; miR398; gene expression regulation; stress response; cold response mechanism20第一章 文献综述低温、干旱、盐碱、矿物质缺乏等是日常生产作业中对植物生长发
8、育以及作物产量造成影响最大的非生物胁迫。日常生活中的众多重要的作物，好比玉米、水稻、大豆和甘蔗等，大多抗冷性差，易受冷胁迫危害。在它们长期的进化过程中,产生了多种抗胁迫机制,涉及到许多代谢过程以及生理和分子水平的表达调控, 其中胁迫应答基因在转录水平与转录后水平的表达尤为重要1。MicroRNA(miRNA)通过切断靶基因的mRNA分子，抑制靶基因的翻译，或者以上两种, 进而对靶基因的表达进行水平负调控，从而参与到转录后基因的表达中，对植物的生长发育进行调控。在受到外界胁迫时，还可以通过改变表达进而参与植物体内的多种逆境胁迫应答过程。东北是我国玉米的主要生产地区，基于地理位置等因素的影响，在每
9、年的春季都会由于低温冷害的影响，导致大面积的产量降低，在低温冷害特别严重的年份，产量甚至降低高达20。由于外界环境影响，玉米产量波动较大，严重影响了玉米的高产稳产，同时使得玉米的品质也下降很多。由于目前对玉米需求量持续增长，选育出稳定高产的玉米品种，对于国家粮食安全问题具有十分重要。因此对于玉米冷响应机制的研究非常重要而且迫切。miR398在进化的过程中高度保守,因此适合于用来研究其表达机制。研究表明miR398的靶基因是两种Cu/Zn过氧化物歧化酶: 细胞质CSD1、叶绿体CSD2。miR398在多种逆境胁迫响应中的调控功能已得到广泛研究, 其在调节植物铜代谢平衡, 应答过量的铜、铁、镉等重
10、金属胁迫, 蔗糖、臭氧、盐害等其他非生物胁迫, 以及病原菌生物胁迫中均扮演重要角色2。研究冷胁迫条件下不同玉米自交系miR398基因靶基因表达，可用于有效的筛选出抗冷能力强的玉米品种。第一节 低温冷害的类型及其影响 低温冷害 (low temperature, chilling or cold damage) 是主要影响我国东北地区玉米产量的灾害之一，指的是0以上（一般低于20）低温对作物的损害，简称为冷害。指的是当农作物所处环境温度降到生长发育时期所能够忍受的最低温度以下时，作物生理活动受到障碍，严重时生殖器官出现损害，从而导致农作物产量下降的现象。冷害主要存在两种分类方式，一种分类方式是依
11、据在农业气象学中，对农作物的危害的特点划分，分为：一、延迟型。作物生长发育时期受到较长时间的低温侵害，植株生理活性降低引起作物生育期显著延迟，使得作物不能正常按时成熟，导致产量降低。二、障碍型。作物在生殖生长阶段，主要是指作物在孕穗期和抽穗开花期，遇短时间低温,生殖器官的生理机能被破坏而减产3。三、混合型。延迟型和障碍型同年度发生，比单一冷害造成更严重的危害。另一种分类方式则是从灾害角度将冷害分为三种类型：春季低温冷害、秋季低温冷害、东北夏季低温冷害。 在我国东北地区，农作物低温冷害是主要的农业气象灾害之一。东北地区是我国重要的玉米生产基地之一，由于地理位置等因素，该地区农业气候上容易遭受低温
12、冷害，经常出现玉米延迟性低温冷害的现象，导致高温年增产，低温年降产，产量波动较大。一些严重低温的年份甚至会同时造成玉米品质的下降。第二节miRNA研究价值MicroRNA（miRNA），一类负转录后调节因子，已在植物中得到深入研究。目前已经通过实验克隆或计算方法数千种植物miRNA得到鉴定。这些小的非编码RNA由2024个核苷酸组成，由具有独特茎环结构的前体产生。已经证明植物miRNA调节参与多种发育过程（例如生长素信号的传导及RNA代谢和根、茎、叶等器官的生长发育）的许多基。此外，许多miRNA参与到植物对不同环境因素的胁迫应答中。越来越多的研究人员更加关注那些涉及胁迫的作物的miRNA及其
13、在胁迫应答中的机理以及发挥的作用。因此，对于涉及胁迫应答miRNA的鉴定非常重要，特别是对于作物育种来说。2.1研究现状miRNA是生物体内一类重要的小分子RNA，自从首次在线虫中发现miRNA以来，迄今为止miRNA的研究已经取得了飞速的发展，目前研究已明确了miRNA在调控植物生长发育、激素信号转导、响应逆境胁迫、细胞程序性死亡以及新陈代谢等方面起着非常重要的作用，但对其具体作用机制的研究及报道还相当有限，尤其是miRNA在植物响应多种逆境胁迫中的作用途径的报道还较少。目前，研究miRNA如何实现对自身及其靶基因的调控，并揭示其作用机制，阐明miRNA在植物生长发育，尤其是抵御逆境胁迫等过
14、程中的调控机理，已成为重要的研究方向。目前我们已经通过分子生物学的研究对特定植物中miRNA的种类和数量，少数miRNA与其靶基因之间的作用机制有了一定的了解。但是对于整miRNA研究领域仍然有太多的未知等待我们去学习。其中关于miR398的研究需要更进一步的深入和深化研究。第三节 miR398简介3.1 miR398的发现通过实验研究，Sunkar等人在多种逆境胁迫下构建出拟南芥的miRNA文库, 之后Jones- Rhoades和Bartel通过比较基因组学的方法发现miR398具有高度的保守性4。预示miR398可能在各种生物体中的逆境胁迫应答中起着不可忽视的重要作用。3.2 miR39
15、8的靶基因miR398的靶基因为两种Cu/Zn过氧化物歧化酶(CSD): 细胞质CSD1和叶绿体CSD2。miR398与其靶基因在不同植物中都具有着高度的保守性，表明 miR398及其靶基因对于植物在不利于自身生长发育的环境下的胁迫应答过程中起到重要的作用。3.3 miR398与逆境胁迫植物通过过量或者低量表达miRNA来对其靶基因进行负调控，从而使得植物在逆境胁迫下对外界环境做出应答。低温、干旱、盐碱、矿物质缺乏等逆境胁迫，会导致ROS在植物体内快速的产生，并且大量累积。而生物体中最主要的超化物歧化酶CSD则通过将有害的超氧自由基转化为过氧化氢,从而消除了生物体内的超氧自由基，减轻逆境下生物体受到的危害。Sunkar等发现, miR398在强光照、甲基紫精(Methyl viologen, MV)作用下表达受到抑制, CSD1、CSD2 mRNA转录上升。甲基紫精结合到叶绿体类囊体膜上, 将电子转移到O2, 在光下引发超氧自由基的持续产生。 Jagadeeswaran等报道臭氧、盐害等非生物胁迫下miR398表达下调。臭氧抑制miR398的表达, 臭氧胁迫去除后miR398水平逐渐恢复正常。但是, 不同于重金属胁迫下CSD1和CSD2均受到miR398的转录负调控, 臭氧、盐害胁迫下仅CSD1受到miR398的负调控。臭氧、盐害胁迫下miR398表达下调,
