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1、摘 要真菌广泛存在于自然界中，是生物界中的一个很大的种群。到目前为止，世界上被人类记录的真菌约有12万种。真菌与人类生活密切相关，有些真菌有食用价值，有些真菌则具有药用价值，可以生产抗生素或治疗癌症等。植物的内生真菌种类繁多,分布广泛,可以产生各种活性天然产物，是一种丰富资源。目前为止，从植物的内生真菌中得到的次生代谢产物普遍具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗细胞毒等一系列活性。一些结构多样性次生代谢产物来源于毛壳属真菌。已经发现的某些次生代谢产物结构新颖并具有新的生物活性，例如抗炎、酶抑制活性、抗肿瘤、细胞毒性和抗菌活性等。本文以天然产物化学的理论为依据，以微生物的发酵技术、有机溶剂的萃取技术以及
2、柱层析色谱的分离技术为手段，将植物内生毛壳菌TY菌株进行扩大发酵培养，并对发酵液进行了分离提取及纯化。提取物的分离提纯主要通过三种色谱技术即Seghadex LH-20、反相色谱、薄层层析色谱相结合来达到目的。目前已经完成分离纯化工作，并且得到了一些纯度比较高的化合物样品，运用高分辨电子轰击质谱（EI-MS）技术结合氢谱（1H-NMR）技术对分离纯化所得到的物质进行结构鉴定，即可以推断出分离所得的化合物为何，甚至有可能进一步发现新的物质。关键词：内生毛壳菌TY菌株；发酵；次生代谢产物；结构鉴定AbstractThere is a wide range of fungi in nature it
3、 belongs in the biosphere large populations.As of recent years there have been about 120,000 fungi discovered and recorded by humans around the world.Fungus plays an important role in human life and human beings have a very close relationship.Among them some fungi have edible value such as Pleurotus
4、 ostreatus and some fungi have medicinal value such as Ganoderma lucidum which can extract effective substances to treat cancer or produce antibiotics.Plant endophytic fungi a wide range of widely distributed can produce a variety of natural products is a rich resource.So far the secondary metabolit
5、es obtained from plant endophytic fungi generally have a series of activities such as anti-inflammatory anti-oxidation anti-tumor and anti-cytotoxicity.Some structural diversity of secondary metabolites derived from the genus Fungi.Some of the secondary metabolites that have been found are novel and
6、 have new biological activities such as anti-inflammatory enzymatic inhibitory activity antitumor cytotoxicity and antibacterial activity.The main basis of this article is the basic theory of natural product chemistry the use of organic solvent extraction technology microbial fermentation technology
7、 and chromatographic chromatography separation method and means to expand the fermentation of plant endophytic fungus TY strain,and then the fermentation broth was separated and purified and the effective ingredients were extracted.Separation and purification of fermentation broth is mainly through
8、the use of three chromatographic techniques to achieve the desired purpose,the three chromatographic techniques are:thin layer chromatography,reverse chromatography and Seghadex LH-20.So far has been completed separation and purification work and has been extracted from a number of relatively high p
9、urity compounds and structural identification of the sample.At the same time some compounds with high purity have been extracted and identified.The structure is identified by high-resolution electron impact mass spectrometry (EI-MS) combined with 1H-NMR so that it can be clarified what are the compo
10、unds that are isolated and extracted and that some of the new substances may be found.Keywords：Endogenous caterpillar fungus TY;Fermentation;Secondary metabolites;Structural identification24目 录摘 要IAbstractII第一章 前 言1第1节 内生毛壳菌TY菌株化学成分研究现状11.1 内生毛壳菌TY菌株研究现状11.2内生毛壳菌TY菌株研究的重要意义3第2节 分离纯化技术42.1硅胶柱层析42.2 S
11、ephadex柱层析色谱42.3 反相层析柱42.4薄层色谱（TLC）4第3节 结构鉴定主要技术53.1紫外-可见吸收光谱53.2核磁共振波谱（NMR）53.3 质谱53.4红外光谱5第4节 研究背景、目的和意义、方法和路线64.1选题背景64.2研究目的和意义64.3研究路线和方法6第二章 内生毛壳菌TY菌株扩大培养与发酵7第1节 内生毛壳菌TY菌株的扩大培养71.1菌种的保存71.2.实验仪器和试剂71.3 实验方法7第2节 内生毛壳菌TY菌株的发酵82.1实验材料、药品及仪器82.2 实验方法9第三章 次生代谢产物的提取、萃取及分离纯化10第1节 内生毛壳菌TY菌株TY菌株次生代谢产物的
12、提取101.1 实验材料、试剂及仪器101.2 实验方法10第2节 内生毛壳菌TY菌株次生代谢产物提取物的萃取112.1 实验材料、药品及仪器112.2 实验方法112.3 色谱分析112.4 详细流程图13第3节 提取物的分离纯化133.1 实验材料、药品及仪器133.2 C1部分143.3 C2部分143.4 C3部分153.5 详细流程图16第四章 结构鉴定171.1实验材料171.2样品171.3实验仪器171.4结构分析17讨 论18结 论19致 谢20参考文献21第一章 前 言第1节 内生毛壳菌TY菌株化学成分研究现状1.1 内生毛壳菌TY菌株研究现状植物内生真菌是一种极其丰富的新
13、微生物资源，且大部分内生真菌具有增加宿主对外界环境的应激耐受性、促进宿主植物的生长、促进宿主中一些有效活性成分力等方面的作用，在自然界中具有重要的生态学作用，引起了人们广泛的关注并取得很大进展，开发应用前景非常广阔1。故对内生真菌进行全面而深入的研究分析，有着非常重要的意义。但目前，不管是从内生真菌发现的数量，内生真菌开发利用的现状，还是从人们对内生真菌遗传特性及内生真菌与宿主之间关系的了解来看，内生真菌相关研究都处于初级阶段。同时对于从内生真菌次生代谢产物中提取天然产物的关注，国内外鲜有报道2。由于内生真菌代谢产物的实用价值巨大，内生真菌代谢产物及其生物活性是目前科学研究的重要课题，随着研究
14、的不断广泛和深入，揭示了内生真菌能够直接合成或间接促使宿主合成多种药用活性成分，其代谢产物的类型更是广泛，包括了萜类、生物碱类、苯丙素类、黄酮类、甾体类、醌类、糖类、有机酸类、脂类、肽类等多种化合物3。并可通过对发酵条件的改变和控制提高目标菌株的产量，为利用内生真菌工业发酵技术生产重要的药物开辟了新道路，具有极大的应用价值和开发潜力。在药用植物资源相对匮乏的今天，加强对药用植物内生真菌的研究和利用对人与自然的可持续发展，以及医药行业的发展具有重要意义。药用植物内生真菌代谢产物多样，其生物活性各异，尤以抗肿瘤活性、杀菌活性以及抗氧化活性等受到广泛关注。Kunze 在 1817 年发现了第一株毛壳
15、菌，并将其归到球壳科内，同时建立毛壳属(Chaetomium Kunze)，从此拉开了研究毛壳属的序幕4。毛壳属真菌作为植物病原菌的生物防治菌之一，可用于防治多种植物病害。近年来，它已被广泛应用于植物病害的生物防治，其中研究最多是角毛壳（Chaetomium cupreum）与球毛壳（Chaetomium globosum）。2009 年岳会敏等人研究表明角毛壳（C. cupreum）可以抑制核盘菌、大豆疫霉和茄腐镰刀菌三种病原菌的生长，并且抑制效果明显而持久5。V.Shanthiyaa 和 D.Saravanakumar 在 2013 年研究报道了球毛壳（C. globosum）在防治马铃薯晚疫病方面有一定的积极意义6。此外，有研究报道，某些角毛壳或球毛壳能够促进像玉米、番茄、黑胡椒、水稻等植物的生长以获得高产，因为它们可产生一些增强土壤肥力的生长素、麦角甾醇类等次生代谢产物。毛壳属真菌属于霉腐菌的一种，通常情况下不会对动植物产生致病性，但也有特例7。2003 年贾艳梅等人调查研究了球毛壳菌侵染樟子松导致其植株幼苗枯死的规律8。球毛壳菌在农业和工业上都有应用，例如，对病原微生物和蚜虫的生物防治作用；能够分解利用植物木质纤维素，可用于生物能源制造。更重要的是，球毛壳菌还可产生很多有生物活性的次级代谢
