《内皮细胞白细胞黏附分子1在小梁细胞的表达和作用研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《内皮细胞白细胞黏附分子1在小梁细胞的表达和作用研究（89页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国协和医科大学 博士学位论文 内皮细胞白细胞黏附分子-1在小梁细胞的表达和作用研究 姓名：周崎 申请学位级别：博士 专业：眼科学 指导教师：赵家良;刘玉琴 20040101 中国协和医科大学博士生论文 t 3 p B S A c D N A D A B D E P C D M 匣M D M S O d N 口 D T T E B E D T A E L A M 1 E R K F B S F N H E 髓P E S H R P I L 一1 L N M A P K 英文缩写 A b b r e v i a t i o n b a s e p a i r b o v i n es e r u
2、 ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r yD N A d i a m i n o b e n z i d i n e d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e D u l b e c c o sm o d i f i e dE a g l e S m e d i u m d i m e t h y ls u f o x i d e d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d i t h o t h r e i t o l e t h i
3、d i u mb r o m i d e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a c e t a t e e n d o t h e l i al e u k o c y t ea d h e s i o n m o l e c u l e 一1 e x t r a c e l l u l a r s i g n a l r e g u l a t e d k i n a s e f e c a lb o v i n es e r u m f i b r o n e c t i n h e m a t o x y l i n e o s i n ：2 - h
4、 y d r o x y e t h y l - p i p e r a z i n e - N 一2 e t h a n e s u l f o n i ca c i d h o r s e r a d i s hp e r o x i d e s e i n t e l e u k i n 1 J a m i n i n m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e 碱基对 牛血清白蛋白 互补D N A 3 , 37 四盐酸二氨基联苯胺 焦炭酸二乙酯 改良极限必须细胞培养基 二甲基泛砜 三磷酸脱氧核糖核酸 二硫苏糖醇 溴化乙啶
5、 乙二胺四乙酸 内皮细胞白细胞黏附分子一l 细胞外信号调节激酶 胎牛血清 纤维黏连蛋白 苏木素伊红 N - 2 - 羟乙基哌嗪 ，2 乙磺酸 辣根过氧化物酶 白介素1 层黏连蛋自 丝裂酶活化蛋白激酶 4 中国协和医科大学博士生论文 衄 m R N A N F r d 3 O D P B S P C R P D G F P T C R F P C R S D S T B A T C T E 匝D T M 1 “s m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e m e s s e n g e r R N A n u c l e a rf a c t o
6、rk a p p aB o p t i c a ld e n s i t y p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r p o r c i n et r a b e c u l a rm e s h w o r k c e l l r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s e c
7、h a i nr e a c t i o n s o d i u m d e o d e c y ls u l f a t e m i b a b i t u r i ca c i d t r a b e c u l a rm e s h w o r kc e l l N MN N - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e 仃a b e c u l a rm e s h w o r k t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 基质金属蛋白酶 信使R
8、 N A 核因子n 1 3 光密度 磷酸盐缓冲液 聚合酶链反应 血小板衍生生长因子 猪小梁细胞 逆转录聚合酶链反应 十二烷基硫酸钠 硫代巴比妥酸 小梁细胞 M M ， ，四甲基乙二胺 小梁网 三( 羟甲基) 氨基甲烷 5 中国协和医科大学博士生论文 一一 摘要 青光眼是全球主要的致卣性眼病，也是我国首位不可逆的致盲性眼病。了解 青光眼的发病机制，对其进行早期诊断、早期治疗，是研究青光眼的重点课题。 E L 心一l 是目前发现的唯一的青光眼特异性分子标记，对E L A M 一1 的研究将加深对 青光眼发病机制的了解。 到目前为止，E L A M - 1 的研究主要在血管疾病中进行。考虑到小梁网和
9、血管 在结构、功能和病理机制上的相似性，我们借鉴血管性疾病研究的成熟方法，研 究小梁细胞中E L A I 一1 的产生及作用机制，以及其产生和作用过程中伴随的信号 传导过程的改变，推测E L A M l 在青光眼发病机制中的作用。 实验分为三个部分。 一、房水外流通路E L A M 一1 表达的研究 目的；氧化应激、跟压或血压升高分别是青光眼和血管性疾病的主要危险因素。 在血管疾病中E L A M 一1 的表达与液体压力梯度和氧化应激有关，因此我们研究氧 化应激和高眼压对小梁细胞E L A M 一1 表达的影响，了解是否E L A M 一1 的表达与I L 一1 a 有关，试图发现青光眼特异性
10、表达E L A M 一1 的机制。 材料和方法：将原代培养的猪小梁细胞血清饥饿培养1 6 小时，分成对照组、H 。O 。 组和拮抗剂I L l r a 组。I L I r a 组再根据加入I L l r a 的浓度分成若干亚组。对 照组用无血清培养基培养，H 。0 2 组用l m M 的心0 。刺激，各拮抗剂I L - l r a 组先用 2 u g m l 、8 u g m l 、3 2 u g m l 、6 4 u g m 、1 8 0 u g m l 和6 0 0 u g m l 的I L l r a 预处理 过夜后，用1 m M 的也o 。刺激；30 分钟后免疫组化法检测小梁细胞E L
11、 A M l 的表达： 流量恒定眼前节灌流培养成功的猪眼前节2 4 只，分成0 、1 0 、2 0 和3 0 m m H g 组， 培养2 7 2 小时后中性甲醛固定，免疫组化法检测小梁细胞E L A M 一1 的表达。提 取对照组、心魄组细胞以及灌流培养眼前节的各眼压组小梁网的总R N A ，R T P C R 法检测I L l am R N A 的表达，观察小梁细胞表达E L A M - 1 过程中，内源性I L l a m P 矾 A 水平的改变。 结果：在原代培养的猪小梁细胞中，对照组E L A M - 1 表达阴性，H 2 0 。组和2 u g m l 、 8 u g m l 、3
12、2 u g m l 和6 4 u g m l 浓度的拮抗剂I L l r a 亚组E L B t - I 表达阳性， 6 中国协和医科大学博士生论文 1 8 0 u g m 1 和6 0 0 u g m 1 拈抗剂I L i r a 亚组E L A M 一1 表达阴性。流量恒定眼前节灌 流培养猪眼前节，0 m m H g 组、1 0m m H g 组和2 0 砌l t t g 组E L A M l 表达阴性，3 0 m m H g 组E L A M 一1 表达阳性。R T - P C R 结果，各组R N A 提取质量好，阳性内对照均扩增出 片断，实验组除了一个对照组扩增出目的片断，其余均未扩
13、增出目的片断。 结论：本实验结果表明，氧化应激和高眼压可以诱导小梁细胞表达E L A M 一1 。在 体外细胞培养体系，高浓度的i L - i r a 可以拮抗氧化应激的作用。而高眼压状态 时，未能在小梁组织检测到I L l am R N A 的表达。 二、E L A M 一1 对小梁细胞作用及其机制研究 目的：小梁细胞形态、细胞骨架和细胞间隙影响房水外流流畅系数。而E L A M 1 在血管内皮细胞通过肌动蛋白细胞骨架控制内皮细胞的形态。本节实验主要研究 E L A M 一1 表达后触发的下游机制的激活，研究其对小梁细胞形态和细胞骨架的作 用以及对整个外流通路的影响，推测E L A M -
14、1 在青光眼发病中的作用。 材料和方法：1 原代培养的猪小梁细胞血清饥饿1 6 小时，分成4 组：( 1 ) I L 1 组，加入I L - 1 刺激；( 2 ) E L A M - 1 组，用1 1 。1 刺激后，再加入E L A M - 1 抗体：( 3 ) 垮G 组，用I L 一1 刺激后，加入E L A M 1 抗体，再加入I g G 交联；( 4 ) 对照组， 不加入任何药物。对4 组在相同作用条件作用后，用免疫组化法观察小梁细胞 E L A M 一1 的表达；相差显微镜观察小梁细胞形态和细胞间连接的动态改变；以异 硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽( F I T C p h “1 0 i
15、d i n ) 对小梁细胞肌动蛋白进行标记 后，用共聚焦显微镜观察不同作用条件下肌动蛋白和细胞厚度的改变。 2 将猪眼前节分成四个象限，各象限分别作为对照组，I L l 、E L A M i A b 和I g G 组，进行组织块培养。各组先用含血清培养基培养过夜，再分组用不同的条件作 用。对照组用不含血清的培养基培养；I L - 1 组单用I L l 刺激；E L A M 一1 组先用 I L 一1 刺激，再加入E L A M l 抗体；I 邸组在I L - I 刺激，E L A M - 1 抗体作用后再用 I g G 交联。对4 组在相同作用条件作用后固定，分别用光学显微镜和电子显微镜 观察
16、细胞间隙，细胞连接的改变。 结果： 1 免疫组化显示，未经I L 1 作用的小梁细胞不表达E L A M 1 ：I L 一1 作用 后小梁细胞表达E L A M - 1 。相差显微镜和共聚焦显微镜下，对照组和I L 1 组小 梁细胞形态和细胞骨架改变不明显。E L A M 1 抗体组和I g G 组小梁细胞，在相差 显微镜下可见小梁细胞间隙扩大，细胞变圆变厚，细胞立体感增强；在共聚焦显 中国协和医科大学博士生论文 微镜下可见，小梁细胞肌动蛋白变稀疏，荧光弥散，小梁细胞刚性降低，细胞厚 度增加。表明E L A M 一1 表达活化后小梁细胞内肌动蛋白的聚合状态有改变( 解 聚) ，细胞与细胞夕卜基质的黏附能力下降。 2 光学显微镜显示，经过组织块培养法，周边部组织色素丢失严重，睫状体带 与小梁组织分离，中央部位组织保存好，但是小梁网间隙扁平，不充盈；对照组 小梁细胞间隙均
