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1、 毕 业 论 文 （ 2015届本科） 题 目： microRNA对肉牛肌内脂肪沉积 相关基因表达的调控作用研究 学 院： 畜牧兽医学院 专 业： 动物科学 姓 名： 指导教师： 完成日期： 2015年 5 月 6 日目录摘要1Abstract2前言31实验材料与方法91.1试验动物与来源91.1.1 血液样品91.1.2 肌肉组织样品91.2试验所需药品和试剂91. 3主要仪器设备91.4主要试剂的配制101.5 DNA的提取101.5.1肌肉组织DNA的提取101.5.2 DNA浓度和纯度的检测111.6引物设计121.7基因目的片段的扩张121.7.1使用TaKaRa Taq酶试剂盒在冰
2、盒上配置25L体系反应液121.7.2 PCR反应程序121.8序列测定与SNP（单核苷酸突变）定位132 结果与分析142.1筛选得到的mi-RNA的特点142.2 miRNA的分离与靶标结合的特点152.2.1突变前结合的miRNA152.2.2突变后结合的miRNA173结论与讨论20参考文献21致谢24沈阳农业大学学士学位论文摘要 为了研究microRNA对肉牛肌内脂肪沉积相关基因表达的调控作用，本文通过对辽育白牛肌肉组织DNA的提取、DNA浓度和纯度的检测、基因目的片段的扩张、序列测定与SNP定位这些实验，得到了MiRNA的分离与靶标结合的特点，筛选得到的MiRNA的特点等。实验结果
3、表明，利用在线软件查找牛的miRNA,牛的靶标miRNA库包含1608个相关miRNA，用miRBASE软件将HFABP基因与牛的miRNA结合情况分析后发现6个突变前结合的miRNA包括bta-miR-212 MIMAT0009264，bta-miR-411a MIMAT0009312，bta-miR-2370-3p MIMAT0011915，bta-miR-30f MIMAT0009282，bta-miR-3604 MIMAT0016939，bta-miR-2468 MIMAT0012058，,6个突变后结合的miRNA包括bta-miR-421 MIMAT0009314，bta-miR-
4、484 MIMAT0003535，bta-miR-2355-5p MIMAT0011891，bta-miR-2413 MIMAT0011975，bta-miR-2461-3p MIMAT0012048，bta-miR-2474 MIMAT0012065。筛选得到的RNA测序后通过基因序列与波峰的比对发现，在H-FABP基因3-UTR区发现了1个差异位点，170bp位点A/T的突变。microRNA广泛存在于单细胞和多细胞的真核生物中，并在真核基因表达调控中有着重要的作用，它对信号传导、细胞代谢和凋亡、肌细胞生成、病毒感染和癌症等方面影响显著，因此受到了越来越多的关注。本文对microRNA分子
5、及其对动物肌肉发育和脂质代谢的调控以及在一些动物疾病中的作用等进行研究，为今后动物microRNA的研究提供理论依据。关键词：MicroRNA；肌内脂肪；基因；肉牛Abstract In order to study microRNA on beef intramuscular fat deposition related to the regulation of gene expression, the paper extraction LiaoYu white cow DNA of muscle tissue, DNA concentration and purity testing, t
6、he purpose of the expansion of gene fragments, sequencing and SNP locate these experiments, MiRNA got separated and target binding characteristics, features screened MiRNA like. Experimental results show that the use of online software to find cattle miRNA, cattle target miRNA library contains 1608
7、related miRNA, with miRBASE software HFABP miRNA genes and cattle combined analysis found that after the first six mutations bound miRNA include bta-miR- 212 MIMAT0009264, bta-miR-411a MIMAT0009312, bta-miR-2370-3p MIMAT0011915, bta-miR-30f MIMAT0009282, bta-miR-3604 MIMAT0016939, bta-miR-2468 MIMAT
8、0012058, after six mutations bound miRNA include bta -miR-421 MIMAT0009314, bta-miR-484 MIMAT0003535, bta-miR-2355-5p MIMAT0011891, bta-miR-2413 MIMAT0011975, bta-miR-2461-3p MIMAT0012048, bta-miR-2474 MIMAT0012065. After screened by sequencing RNA gene sequence alignment with crest found in H-FABP
9、gene 3-UTR region found a difference between sites, 170bp locus A / T mutation. microRNA widely present in unicellular and multicellular eukaryotes, and plays an important role in the regulation of eukaryotic gene expression, its signal transduction, cell metabolism and apoptosis, myogenesis, effect
10、s of viral infections and cancer significantly, it has attracted more and more attention. In this paper, microRNA molecules and animal muscle development and regulation of lipid metabolism as well as in a number of animal diseases and the like to conduct research, provide a theoretical basis for fur
11、ther study of animal microRNA. Key words: MicroRNA ；Intramuscular fat ；Gene ；Beef cattle前言1 MicroRNA概况 miRNA（microRNAs）是一种小的，类似于siRNA的分子，由高等真核生物基因组编码，microRNAs通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译。microRNAs在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的microRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，microRNAs组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明microRNAs
12、在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。1.1 miRNA 定义 miRNA 是一类进化上保守的非编码小分子RNA，具有在翻译水平调控基因表达的功能。尽管第一个microRNA 早在1993 年被发现，一直到最近几年这类基因的多样性和广泛性才被揭示出来。据推测脊椎动物基因组有多达1000个不同的 microRNAs，调控至少 30%以上的基因表达。1.2miRNA的特性在个体发育过程中起重要作用在组织中广泛表达，在不同组织中表达不同参与病毒感染过程和原癌基因有关1.3miRNA 的生成 在细胞核内，基因组DNA转录生成较长的RNA分子（可长达1000nt），被双链RNA 特异的核糖核酸酶
13、Drosha 切割成长度大约70-100碱基的、具发夹结构的RNA分子（前体microRNA）。这些发夹结构的RNA 通过核输出蛋白exportin5 机制转运到细胞质，然后被第二个双链 RNA 特异的核糖核酸酶Dicer 切割，得到19-23nt 大小的成熟的microRNAs 产物。成熟的单链microRNAs与类似RNA诱导沉默复合物(RISC)结合，并参与 RNA 干扰反应(RNAi)。在动物中，结合在复合物上的 microRNAs 以一种目前尚未完全清楚的机制结合到序列基本互补(并非完全互补)的mRNA 上,但这种结合往往不像RNAi 反应那样参与 mRNA 降解,而是阻止所结合的m
14、RNA 的翻译，导致相应基因表达水平的下降。大约60%的microRNAs为独立表达，15%左右的microRNAs成簇表达，还有25%的microRNAs位于内含子。1.4microRNAs原理 microRNAs基因通常是在核内由RNA聚合酶II(polII)转录的，最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-microRNAs。pre-microRNAs在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-microRNAs。RANGTP和exportin 5将pre-microRNAs输送到细胞质中。随后，另一个核酸
15、酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的microRNAs:microRNAs*双链。这种双链很快被引导进入沉默复合体(RISC)复合体中，其中一条成熟的单链microRNAs保留在这一复合体中。成熟的microRNAs结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。 与靶mRNA不完全互补的microRNAs在蛋白质翻译水平上抑制其表达（哺乳动物中比较普遍）。然而，最近也有证据表明，这些microRNAs也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种机制的microRNAs结合位点通常在mRNA的3端非翻译区。如果microRNAs与靶位点完全互补（或者几乎完全互补），那么这些microR
