内源性哇巴因在弱精子症发病机理中作用的初步探索

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1、华中科技大学 硕士学位论文 内源性哇巴因在弱精子症发病机理中作用的初步探索 姓名：万艳 申请学位级别：硕士 专业：妇产科学 指导教师：苏萍 20090501 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 II 内源性哇巴因在弱精子症发病机理中作用的初步探索内源性哇巴因在弱精子症发病机理中作用的初步探索 华中科技大学同济医学院计划生育研究所 武汉 430030 硕士研究生 万艳 导 师 苏萍 副教授 中文摘要中文摘要 实验一实验一 Ouabain 及其受体及其受体 NKA-1抗体、抗体、NKA-4抗体抗体 对正常人精子运动功能的影响对正常人精子运动功能的影响 目的目的

2、研究 Ouabain 及其受体 NKA-1抗体、 NKA-4抗体对正常人精子运动功 能的影响。 方法方法 按世界卫生组织标准选取正常精液标本 60 例，上游法进行优化，其中 30 例分别与不同浓度（110-2 M110-7 M）Ouabain 共孵育，采用 CASA 系统检测精子 运动功能的变化，观察指标为 a+b 级精子百分率、精子活动率、直线速度、鞭打频率、 直线性、 前向性、 摆动性等； 另外 30 例分别与 NKA-1抗体和 NKA-4抗体共孵育， CASA 检测精子运动功能的变化，观察指标同上。 结果结果 1、 Ouabain对精子活动率和a+b级精子百分率的影响呈现出一定的时效性，

3、 随着时间的延长有逐渐降低的趋势；较高剂量（110-2 M110-5 M）Ouabain 与优化 后的精子共孵育 4h 后，精子活动率下降了 62.7%68.4%，与阴性对照组相比差异有 显著性（p0.05） ；其余精子运动参数包括曲线速度、鞭打频率、侧摆幅度、平均位移角度 均未见明显变化。2、加入 Anti-1 和 Anti-4后的精子活动率分别下降了 28.1 2.8%和 32.93.4%， 与对照组相比差异均有极显著性 （p0.05） ；加入 Anti-1 和 Anti-4后的 a+b 精子百分率 分别下降了 38.73.8%和 53.24.4%，与对照组相比差异均有极显著性（p0.05

4、）; The rest of movement parameters had no statistical significance. 2. The sperm activity ratio was decreased by 28.12.8% and 2.93.4% respectively after co-incubated with Anti-1 and Anti-4（p0.05）; The sperm motility was decreased by 38.73.8% and 53.24.4% respectively after co-incubated with Anti-1 a

5、nd Anti-4 （p20106/ml；a+b级精子百分率(活力)50%或a级精子25%；正常形态精子 30%；精子存活率75%；白细胞少于1106/ml。 二、主要试剂及配置 二、主要试剂及配置 Ouabain Sigma（St. Louis, USA） NKA-1抗体 Santa Cruz（USA） NKA-4抗体 迈阿密大学Paul F James教授惠赠 BWW精子优化液 自行制备 Hepers Sigma（St. Louis, USA） 其它常用试剂: NaCl、KCl、HCl、CaCl2、KH2PO4、Na2HPO412H2O、NaHCO3 MgSO47H2O、葡萄糖、乳酸钠、H

6、epers、丙酮酸钠 PBS (0.01 mol/L) pH 7.27.4 在800 mL蒸馏水中融解 NaCl 8g KCl 0.2g KH2PO4 0.2g Na2HPO412 H2O 2.9g 用1 N HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1 L BWW液的配制（参考人类精子学） 储备液： NaCl 4.589 g KCl 0.365 g CaCl2 0.25 g KH2PO4 0.162 g MgSO47H2O 0.292g 加双蒸水至1000ml 高压灭菌后备用 工作液： NaHCO3 0.21 g 葡萄糖 0.1 g 乳酸钠 0.37 g Hepers 0.52 g 华华 中

7、中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 7 丙酮酸钠 0.003 g 加入100 ml储备液中溶解，0.22 m微孔虑膜过滤后备用 Ouabain溶液 Ouabain母液：Ouabain 0.0585 g + PBS 1ml ； 110-2 M：母液100 l + PBS 900 l； 110-3 M：110-2 M 100 l + PBS 900 l； 以此类推， 分别得到终浓度为110-4 M、 110-5 M、 110-6 M 、 110-7 M Ouabain 溶液。 NKA-1抗体工作液 母液2 l + PBS 198 l，即1：100 NKA-4抗体工作液

8、母液4 l+ PBS 198 l ，即1：50 三、主要仪器和设备三、主要仪器和设备 低速离心机 LDZ5-2型 北京医用离心机厂 CO2培养箱 MCO-15AC型 日本三洋公司 恒温水浴箱 DK-S22型 上海精宏实验设备厂 超净工作台 FLC-3型 哈尔滨市东联公司 CASA JY9000型 北京伟力科技发展有限公司 电子天平 AE-240型 沪梅特勒托利多仪器有限公司 解剖显微镜 SZ11型 日本Olympus 微量进样器 1000 l 德国 Eppendorf公司 微量进样器 100 l 德国 Eppendorf公司 微量进样器 10 l 德国 Eppendorf公司 其它常用仪器及器

9、械：载玻片、盖玻片、高压蒸汽灭菌器、干烤箱、离心管、 一次性塑料试管、吸管、枪头等。 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 8 四、实验方法四、实验方法 1不同浓度的不同浓度的Ouabain溶液对人精子运动功能的影响溶液对人精子运动功能的影响 （1）精子优化（上游法）精子优化（上游法） 精液37液化30min后，参照文献（WHO, 1999）用上游法优化精子。操作在 超净工作台上进行（室温2530），主要步骤为： 1) 在液化精液中加入等体积37 预热的BWW液，用一次性巴斯德（无菌）吸管 充分混匀。 2) 室温500 g离心15 min。 3) 弃上清，留约

10、为沉淀3倍液体。 4) 用200 l 吸头反复吹打，充分混匀沉淀。 5) 取约300 l 已混匀的沉淀置于10ml尖离心管底部，沿管壁缓慢加入2 ml 37 预热的BWW液。 6) 将离心管缓慢斜放于一烧杯内（离心管与水平面成45角），小心将烧杯放入 5% CO2培养箱内。 7) 4560 min后小心拿出烧杯，取交界处云雾状部分即为优化精子。 8) CASA分析（带37保温台）优化后精子的运动功能，并用37预热的BWW 液调整密度为5个/高倍视野。 （2）优化精子的体外干预优化精子的体外干预 将每份优化后的标本分装在七个Ep管中，每管100 l，第一管加入4 l 0.01M PBS，第二至第

11、七管分别加入等量不同浓度的Ouabain溶液（110-2 M 110-7 M），分别定为阴性对照组和Ouabain处理组。在Ep管盖上用无菌眼科剪 尖扎一小孔，放入37、5% CO2培养箱内培养。 （3）精子运动功能的测定精子运动功能的测定 Ouabain处理组和对照组精子体外培养0h、1h、2h、3h、4h后，用吸头轻轻 吹打混匀精子悬液，取8 l于预热的精子计数板上，放在37保温台上，CASA 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 9 分析精子运动功能的变化。观察指标为：精子活动率、a+b级精子百分率、曲线 速度、鞭打频率、侧摆幅度、平均位移角度。 2NK

12、A-1抗体和抗体和NKA-4抗体对人精子运动功能的影响抗体对人精子运动功能的影响 （1）精子优化（上游法）同上；精子优化（上游法）同上； （2）优化精子的体外干预优化精子的体外干预 将每份优化后的标本分装在三个Ep管中，每管100 l，其中： 第1管：加入4 l PBS，置于37、5% CO2培养箱内孵育，定为阴性对照。 第2管： 加入4 l NKA-1抗体工作液， 置于37、 5% CO2培养箱内孵育1h （封 闭NKA-1）； 第3管：加入4 l NKA-4抗体工作液，置于37、5% CO2培养箱内孵育1h （封闭NKA-4）。 （3）精子运动功能的测定精子运动功能的测定 Ouabain处

13、理组和对照组精子体外培养0 h、1 h、2 h、3h、4 h后，用吸头轻 轻吹打混匀精子悬液，取8l于预热的精子计数板上，放在37保温台上，CASA 分析精子运动功能的变化。观察指标为：精子活动率、a+b级精子百分率、曲线 速度、鞭打频率、侧摆幅度、平均位移角度。 五、统计学分析五、统计学分析 所有数据均用xs表示， 采用SPSS 11.5统计分析软件进行单因素方差分析、 t检验 等计算分析，p0.05）。 精子活动率（精子活动率（%） a+b 级精子百分率（级精子百分率（%） 0h 1h 2h 3h 4h 0h 1h 2h 3h 4h 0 86.96.6 83.36.1 81.16.1 81

14、.13.579.66.3 67.46.664.86.564.68.5 62.35.9 64.05.4 110-2M 86.96.6 54.410.240.59.1 35.37.427.56.867.46.626.97.220.78.9 14.48.9 10.24.6 110-3M 86.96.6 54.19.0 46.07.5 41.68.329.99.967.46.629.38.325.87.9 20.26.4 12.57.68 110-4M 86.96.6 54.77.9 45.97.4 47.68.932.45.667.46.633.75.620.84.8 15.34.7 11.93.6

15、 110-5M 86.96.6 59.57.0 46.86.9 41.46.129.76.467.46.630.26.923.85.1 14.55.8 9.73.6 110-6M 86.96.6 79.58.5 67.54.4 66.43.860.78.5 67.46.662.28.255.16.7 51.66.2 50.95.9 110-7M 86.96.6 78.34.6 67.86.3 65.24.563.34.6 67.46.662.87.956.37.3 55.76.5 50.96.4 与阴性对照比较 p0.05）。 （ （3）其它运动参数其它运动参数 其它运动参数如曲线速度、鞭打频率、侧摆幅度、平均位移角度均无显著性变 化（表1-3） 。 图1-2 不同浓度Ouabain孵育后a+b级精子百分率的变化 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0h1h2h3h4h a+b级精子百分率（%） Fig1-2 The change of sperm motility co-incubated with Ouabain of differ