《不可忽视的转膜和封闭WesternBlot专题(经验篇)讲解》由会员分享，可在线阅读，更多相关《不可忽视的转膜和封闭WesternBlot专题(经验篇)讲解（23页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、不可忽视的转膜和封闭:WesternBlot专题(经验篇) 生物通技术专题：既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。Western印迹要想做的好，当然每个步骤都不能马虎，看看这张图，从电泳，转膜，封闭，一抗，二抗到最后的检测，就像“发现号”升空的120万个步骤那样一个也不能少。如果忽视了其中的一步，结果做不出来，也是令人非常头痛的。 “工欲善其事，必先利其器”，要想有好的实验结果，好仪器是相当重要的，因此让我们先来看看什么样的仪器能让我们无后顾之忧，顺利痛快的一步到位。 Western 印迹的仪器主要就是电泳系统和电转移系统了，最好的品牌当然是Bio-R
2、ad和Amersham（GE Healthcare）的Hoefer系列了，现在国内出品的物美价廉的电泳系列产品，也是不错的选择，几乎每个实验室都需要至少一套Mini Cell吧？如果还没有你该怎么挑选呢。一、Bio-Rad经典Mini系列 Bio-Rad Laboratories由 David Schwartz 先生和妻子化学家Alice Schwartz于1957 年创建，总部位于加州 Hercules，下设三大部门生命科学部，临床诊断部和工业材料部，其中生命科学部成功跻身世界排名前五名。在2004年，Bio-Rad还低价收购了因侵犯知识产权限于困境的MJ Research，使得伯乐在PCR
3、领域的市场份额骤然扩大。Bio-Rad生命科学部产品包括蛋白组研究产品、层析仪与填料、蛋白质和核酸电泳产品等，不过最为普通实验室熟悉的莫过于蛋白电泳Mini系列和层析仪。只要是提到SDS-PAGE，Bio-Rad绝对是每个实验室首先考虑的品牌，经典就是经典呀。 Mini-PROTEAN3电泳系统与Mini Trans-Blot转移系统这一套Mini系列可谓是Bio-Rad最多人熟悉和称道的产品了。自上个世纪50年代Raymond利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛性质来延缓蛋白质的迁移率从而达到分离蛋白的目的以来，经过这么多年来的发展， SDS-PAGE电泳技术已经基本成熟了。而且在操作手段方面也越来越
4、简便，越来越准确。Mini Protein Cell的出现使得Western的制胶和电泳的消耗成本更经济、操作更简便快速这种简便也间接促进了Western技术的更广泛采用。而Mini-PROTEAN 3 自被生产出来那天就可以说是“踩在巨人的肩膀上”，因为它吸取了Bio-Rad之前第一代和PROTEAN 2微型垂直电泳仪的优点，并在其基础上进行了优化，所以获得了全球实验人员广泛的认同与喜爱。 Mini-PROTEAN 3的优点可以概括为8个字用途广泛，操作简便。由于Mini-PROTEAN 3可以用于SDS-PAGE变性电泳、非变性电泳、Tric-Tricine电泳、等电聚焦和酶谱分析，以及d
5、sDNA、ssDNA和RNA的电泳分离，因此可以说只要实验室有一套Mini-PROTEAN 3，足以应付常规垂直电泳需要了。Mini-PROTEAN 3体现了Bio-Red不断改进的努力方向设计人性化，令操作更简便这在各个细节都可以体现，比如说为了防止制胶过程出错，Mini在玻璃板，夹合器（固定玻璃板的装置）以及电泳槽里等处分别都有注明正反位、夹板高度或正负极；方便的夹子取代了以前需要拧4个螺丝来固定玻璃板的麻烦。由于未交联的聚丙烯酰胺本身是神经毒素，因此每个实验者都希望操作能简单快速，尽可能减少讨厌的意外“事故”漏胶的发生。Mini-PROTEAN 3巧妙的设计使得配胶快速方便的同时更大大减
6、少漏胶的几率。除此之外，Mini的加样容量也是可以多样选择的，包括10-well (30 l)，15-well (15 l)，10-well (50 l)，12-well (20 l)，9-well (30 l)，IPG comb (7 cm IPG strip)。 电泳结束后就要转膜。同系列的Mini Trans-Blot可以说是Mini-PROTEAN 3的“完美拍档”，它们组合在一起就是做Western印迹实验的最好选择之一了。说它好，当然是有原因的，由于Mini Trans-Blot在转移过程当中的三个关键步骤里设计巧妙，帮助转移顺利进行，提高了转膜效率，因此才会得到如此多的用户的赞赏
7、。第一就是在夹板盒，由于转膜过程中的气泡问题对于实验结果有很大的影响试想一下，在特异带显色处正好有一个气泡，那么本来可以很漂亮的结果就付之一炬了，甚至可能会造成假阴性结果。Mini Trans-Blot的夹板盒通过两块海绵与封口式设计帮助减少气泡的存在，同时夹板盒多孔的设计也可以在压制过程中使缓冲液均匀的渗出，减少气泡。其次，转膜槽的人性设计。试问一下，在转膜中最怕什么，我想大部分人都会说是正负极弄错，Mini Trans-Blot为了防止这种造成整个实验完全失败的情况出现，在转膜槽的正负极上明确的用大范围的红与黑这两种颜色标志出来了，这样出错的可能性就大大降低了。第三，就是Mini Tran
8、s-Blot的冷却装置。Mini Trans-Blot有一个冷却盒，听起来好像很复杂，其实就是一个塑料盒子，但是这个盒子在转膜过程中却可以起重要作用，众所周知，转膜过程中发热不仅会造成气泡的形成，而且很有可能会影响蛋白的正常转移，因此大多数转移是在冰上进行的，但由于空气的隔热现象往往效果不是很明显，利用Mini Trans-Blot，实验人员可以在冷却盒中装入缓冲液将其冰冻起来，转膜时就可以起到冷却的作用。除了以上这些，Mini Trans-Blot还有一次可以转两块膜，低电压过夜转膜以及令人放心的外观设计等方面的优点。Mini-PROTEAN 3加上Mini Trans-Blot一套价格不便
9、宜，要1000多美元呢。现在那个超薄硬质玻璃板也可以单买了，以前可是十套打包的。 Bio-Rad除了这个“镇店之宝”外，还有适合于13.3 x 8.7 cm gels的Criterion系列（Mini系列是8.6 x 6.8 cm），这一系列无论是电泳系统还是转移系统都和Mini相似，但是它可以容纳更多块胶，为蛋白质组分析提供便利。而且有线电极和板电极两种方式供选择。除此之外，还有更大尺寸的the Trans-Blot Cell(16 x20cm，26.5 x28cm)适合特别的需要的实验来选择。二、电泳世家Hoefer 也许国内的研究人员不那么熟悉Hoefer，但是这个1967就成立的公司在
10、电泳产品领域可谓赫赫有名。多年来一直专注于核酸和蛋白电泳分离技术，使得其产品质量和设计一直处于领先地位，在国外真正属于“顶级”口碑的电泳产品。被GE收购了的Amersham则是大家非常熟悉的品牌（包括独步天下的原法码西亚的蛋白纯化王国），而多年为Amersham代工生产单向电泳产品的正是Hoefer。2003年Hoefer成为著名的哈佛生命科学全资子公司，GE（Amersham）目前继续销售Hoefer的各种产品，而且8月期间还有6到7折的特别优惠，很值得看看（点击这里）。老实说GE的这一单向电泳系列一直算是良心价，和美国Hoefer的价格差不多，如果算上这么大的折扣优惠，在美国也买不到这个价
11、格呢！ GE（通用电气公司）有一个很有名的创始人托马斯爱迪生，自1896年爱迪生电灯公司和休斯顿电气公司合并成立GE公司以来，GE秉承着“梦想启动未来”的理念逐渐成为了一家多元化的科技、媒体和金融服务公司。2004年4月，GE宣布成功收购Amersham公司所有股票，自此GE Healthcare在生命科学领域的发展生机勃勃，充满朝气，继续拓展Amersham在基因组，蛋白质组，分离纯化，检测试剂等领域打下的王朝。 在蛋白电泳与印迹系统方面，Amersham做得标准全面，有各种的可以放置不同凝胶数目、凝胶面积和厚度的电泳槽可供选择，通常可以分成三类：微型、中型和大型，另外电转印迹系统也有多种选
12、择，比如说如果你想做半干转移，那么就可以选择Hoefer TE70或Hoefer TE77，如果是要做全湿转移，那么Hoefer TE22或TE62是可以考虑的购买对象。所以如果你刚开始接触蛋白电泳和Western印迹，那么可以考虑一下GE公司（Amersham）的产品，因为这些产品不仅购买放心，而且在产品服务方面也相当不错，能够找到众多有用的资料。别具一格Hofer MiniVE Amersham在电泳仪器方面挑选范围广，而在蛋白垂直电泳系统中一定要提及的就是Hofer MiniVE了，这一设计完整、使用方便的新一代电泳仪器融合了蛋白电泳与Blot两方面装置配备，设计独特，而且在前一段时间G
13、E公司大减价活动中，全套MiniVE只要560美元，只用花一套仪器的钱就可以用作两种用途，这么著名的品牌，真是难得物美价廉啊（如果连同电泳电源还可以再打折哦，晕.）。 说它是好货，那么到底MiniVE是好在哪儿呢？其实在众多电泳仪器倍出的江湖，MiniVE有三招让其独步武林，第一招就是操作简便，节省时间。由于有时蛋白电泳使用频率很高，所以实验人员当然会希望操作简单啦。MiniVE配胶过程就三步：load clampcast，只需把玻璃板放上去，夹紧，然后灌胶就完事了。漏胶？那是极少发生的事。细微之处见真功，MiniVE的设计有一些过人之处。比如Spacer有T边，大大减少侧边漏胶的几率；而将玻
14、璃装到模块上的时候，两边底部的玻璃/Spacer/玻璃处都有Guide Foot，顶一下“三件套”的上面就可以保证足部完全对齐防止底部漏胶。装玻璃的时候如果传统的“插进模块”就容易导致Spacer和玻璃之间“走位”，MiniVE的模块两个侧边和底部都可以打开，将装好的玻璃平放，合上夹边再拧螺丝就行；底部的封边也很特别，有3档，一个是密封档，可以密封底边后直接倒胶；一个是半开的电泳档，允许电泳液均匀连通胶底部，另一个当然就是完全打开以便装卸玻璃了。所以MiniVE并没有单独的倒胶架子，将底部封条推到密封位置后就可以将模块“挂”在电泳主槽的边上倒胶了，不用担心胶面不平哦。Amersham产品做工精
15、良，值得信赖的。第二招，高品质大容量。MiniVE与一般蛋白电泳相比，有个很大优势，就是其蛋白胶可薄至0.5mm，而且凝胶大小是1010.5cm(WH)，比一般的108cm要长了30%，这样的好处就是增加了蛋白分辨率，使一些“难舍难分”的蛋白组分“分道扬镳”，达到更好的分离效果。ViaFect转染试剂第三招，Western印迹，MiniVE采用的转移槽是“盒式”的，润湿的转移膜和滤纸、海绵组成“三明治”结构夹在“盒式”的转移模块中，闭合后每个转移模块只用350毫升的缓冲液，放入主槽中；而电泳主槽里只放预冷的去离子水作为降温，就可以直接转膜了。这种转移方法不用整个电泳主槽装满电泳转移缓冲液，可以
16、节约不少缓冲液（1.21.7升）呢，而且可以减少不均匀的发热。Amersham除了这种微型的电泳系统，还有Hofer其它系列，比如SE250垂直电泳仪，这种电泳系统配有热交换模块，可以消除smile现象（一种由于热量交换不及时而引起的蛋白带波动现象，生物通注）。再比如凝胶大小为1816cm的SE600 Ruby，以及为了蛋白质组学研究的需要开发的Ettan DALT six和Ettan DALT twelve，这两种电泳系统分别可以进行6块和12块凝胶的电泳，这可以说是“库斯拉级”的电泳系统啊！三、国产品牌 国产电泳仪，国内的老牌六一是大家非常熟悉的产品，价格的绝对优势令其历时数十年而屹立不倒。电泳仪这玩意本来技术含量不比芯片扫描仪什么的，只要设计合理好用，电极丝笔直耐用分离效果好，塑料槽晶莹剔透美观易清洗，价格合
