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1、Illumina 平台测测序原理及常见见 几 种测测序文库库构建流程简简介 目 录录 第一部分：测测序测测序原理与流 程 简简介 文库库构建( 6 hrs) cBot HiSeq2500 MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace 1-8 samples 1-8 samples DNA Illumina 测测序流 程 文库库构建( 6 hrs) cBot HiSeq2500 1-8 samples MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 1-8 samples GA IIx MiSe
2、q HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace DNA 文库库构建流 程 片段化 DNA 末端补补平 3加A 接头连头连接 PCR 高质量DNA文库结 构 文库构建的目的是在目的DNA片段两端都连接上想 要 的接头 此单链部分与 FlowCell表面上P7接 头相同 此单链部分与 FlowCell表面上P5接 头相同 Index Sequencing Primer 文库库构建( 6 hrs) cBot HiSeq2500 MiSeq 1-8 samples HiSeq2000 HiSeq2500 1-8 samples GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS M
3、SR CASAVA BaseSpace 测序芯片 (Flow Cell)简 介 flow cell是有2个或8个泳道(Lane)的 玻璃片，与一元硬币的厚度相当 每个泳道(Lane)内的上下两个表面 随机的布满了能够与文库两端接头 分别互补配对的寡核苷酸 (oligos,P7 和P5接头) 在flow cell上进行cluster簇生成 仪仪器简简 介 单单条 DNA 模 板 约约1000条 DNA模板的 拷贝贝 cBotHiSeq Sequen ncceerr 35个循环的桥式 PCR cBot 工作流程 DNA文库变 性：使用NaOH将双链DNA文库变 性为单 链 模板链杂 交：将单链 D
4、NA模板杂交到Flow Cell 上 第一链合成：以Flow Cell 表面上的oligos为引物， 合成第一链 桥式PCR ： 冲走单链 DNA模板，以合成的第一 链 为模板进行35循环的桥式 PCR 线性化 ： 将与P5接头连 接的DNA链从Flow Cell 上去 除 阻断3OH：防止在后续测 序过程中继续 延伸DNA 链 杂交测序引 物 DNA模板杂交和一链合 成 接头头序列 5-3 延伸 含有P7和P5两种接 头 的FlowCell表面 单链 DNA分子与FlowCell 表面的对应 接头杂 交 以杂交的单链 DNA为模板 ， FlowCell上的接头为引 物， 合成第一链 新合成的
5、 链 原始模板 链 双链DNA变 性 丢丢弃原始模板 链链 模板链被冲洗 走 新合成的链留在FlowCell 上 桥式PCR扩 增 单链 DNA与FlowCell表面对应 接头 杂 交，形成“桥” 以接头为引物进行扩 增 桥式PCR扩 增 变 性 变性双链的“桥 ” 得到与FlowCell相连的两条互 补 的单链DNA分子 第二轮桥式PCR扩 增 完成桥式PCR扩 增 完成28循环的桥式 PCR 线性 化 双链“桥”变性为单 链 红色箭头为 P5接头上 的 切割位点 线性 化 切割并冲走与P5接头相连的 那 条DNA链 阻断 阻断3 OH 杂交Read 1 引 物 Read1 测序引 物 将测
6、序引物杂交到文库的接头 上 Illumina 测测序流 程 HiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace 文库库构建( 6 hrs) cBot HiSeq2500 1-8 samples MiSeq 1-8 samples 进行Read1 测序 杂交Index 测序引物，进行Index 测序 Paired End Turnround，合成Read1互补 链 杂交Read 2 测序引物，进行Read 2 测序 HiSeq SBS 测序流 程 HiSeq SBS 测序流 程 1 2 3 Paired End Tu
7、rnaround Sequencing By Synthesis，SBS测序原理 4种 Fl-NTPs + 聚合酶 拍照，收集信号 去阻断，切除荧荧光基 团团 X 36 - 151 可逆终止化学反 应 一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子 ) 准确度高 可以得到同聚物序列 合成 照相，收集信号 去阻断，切除 荧 光基团 下一个碱基合成 100 Microns Clusters 已完成测序合成的片 段 Blocked 3-ends 变性掉已完成测序合成 的 片段 恢复被阻断的3 OH Paired End Turnround 形成的 桥桥 5-3延伸 桥式 PCR 5-3延伸 Paired E
8、nd Turnround 形成的双 链链的桥桥 Paired End Turnround 模板 链链 Paired End Turnround 等温变性，完成15轮桥 式 PCR后，进行线性化，将 模 板链切除，保留新合成 的子 链 新合成的 链链 3 -OH阻 断 Read2测测序引 物 Paired End Turnround 线性化，3 -OH阻断 杂交Read2测序引 物 Sequencing By Synthesis 2nd Read X 36 - 151 4种 Fl-NTPs + 聚 合酶 拍照，收集信号 去阻断，切除荧荧光基 团团 Illumina 测测序流 程 HCS/RTA
9、ICS MSR CASAVA BaseSpace 文库库构建( 6 hrs) cBot HiSeq2500 1-8 samples MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 1-8 samples GA IIx MiSeq 第二部分：常见见文库库构建流程 简简 介 文库分 类 DNA类类文库库 DNA小片段文库 DNA大片段文库 Exon文库 PCR-Free文库 简化基因组文库、单细 胞样 本 文库等 RNA类类文库库 转录组 文库 表达谱（RNA-Seq ） Small RNA DNA小片段文 库库 DNA小片段文库 片段大小在1Kb以下的普通DNA文库 （200bp,350bp
10、,500bp） DNA小片段文库可用来进行人重测测序，动动植物 、 微生物的de novo和重测测序，16s rRNA测测序 ， 宏基因组测组测 序等项目类型的文库构建。 DNA小片段建库流 程 DNA小片段建库流 程 DNA小片段建库流 程 DNA小片段建库流 程 DNA大片段文 库库 DNA大片段文库，又名末端配对（mate-paired ） 文库 片段长度大于1K bp。 主要用于动动植物，微生物的de novo 测测序 DNA大片段文库建库流 程 DNA大片段文库建库流 程 为为什么要建大片段文 库库 Exon文 库 人类外显子组总 共约30Mb，占全 部人类基因组约 1%。 外显子具
11、有高度的保守型，且大部 分疾病的致病位点位于外显子区。 外显子测序是指利用序列捕获技术 将外显子区域DNA捕捉并富集后 进行高通量测序的基因组分析方法 。 Exon文库主要用于人全外显显子测测 序 和目标标区域测测序 Exon文库流 程 外显子捕获方 式 液相杂杂交 液相杂交是通过在溶液中 ， 利用链碱基配对的原理 ， 将DNA片段与探针杂 交， 然后洗脱，富集目的 片段。 Exon测测序特 点 优点： 1、 与全基因组测 序相比，外 显子测序具有测序覆盖度更深、 数据准确性更高、花费成本更 低 等优势 ，对研究已知基因的 SNP、Indel等具有较大的优势 。 不足： 1、与全基因组测序相比
12、，不 能 检测 到基因组内较大的结 构性 变异。 2、与转录组测 序相比，不能 检 测到新的基因。 PCR-Free文 库库 PCR-Free文库，顾名思义，就是在文库构建 过 程中不需要进行PCR的文库。 主要是针对一些特殊样本，比如GC含量高， PCR扩增困难的样本；PCR产物。 不足： 所需的样本起始量较多。 PCR-Free文库与普通文库比 较 简简化基因组组(RAD-seq )文 库库 RAD-seq 即基于酶切的简化基因组测序技术，是指利用 限制性内切酶对基因组进行酶切，结合一定大小的插入 片 段文库，对其进行高通量测序，快速鉴定高准确性的 变异 标记（SNPs）信息的技术 与传统
13、技术相比，该类技术操作简单、不受参考基因组 限 制、可简化复杂基因组；另外，基于SNPs 的分子标 记技 术性价比高，稳定性好，在基因组中分布更加广泛 ，特别 是适合大样本量的分析。 简简化基因组组文库库建库库流 程 转录组转录组 文 库库 真核生物原核生物 总总 RNA 利用Oligo (dT)富 集mRNA 去除 rRNA 随机引物六聚体反转转 录录合成cDNA 末端修复，加A，加 接头头后PCR扩扩增 Illumina 测测序 将mRNA 随机打断成 200 nt 转录组测 序的研究 对 象为特定细胞在 某一 功能状态下所 能转录 出来的所有 mRNA。 应用： 转录本的种类和基 因 定
14、量 基因的转录结 构 可变剪切 发现新的转录本 链链特异性转录组转录组 建 库库 使用ssRNA-seq可以确定转录本是来自正链还是负链。 以 便更加准确的获得基因的结构以及基因表达信息，并 且发 现新的基因。 很多基因组区域具有正负链的转录本，反义转录 是真核 基 因的一个特征，是一种重要的调控方式。 常规转录组 建库方法基 础上，在合成第二条 cDNA链时，替换dTTP 为dUTP，加上接头后 降 解含dU的DNA单链 。 链链特异性转录组转录组 建 库库 均一化（DSN）建 库库 方法：构建常规转录组 文库，库检合格后取80-100ng文库进行DSN 处 理，然后PCR再次出库。 目的：
15、减低高丰度表达基因，有效富集低丰度表达基因。 DSN酶：双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN)，能够选 择性降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA,由于高丰度的基因 形 成双链的速度较快，所以降解也比较多。 RNA-Seq 是用来研究某一生 物对象在特定生 物 过程中基因表 达差 异的技术， 具有定 量准、可 重复性高 、检测范围宽、 成 本低等特点。 真核生物原核生物 总总 RNA 利用Oligo (dT)富集 mRNA 去除 rRNA 随机引物六聚体反转录转录 合 成cDNA 末端修复，加A，加接头头后 PCR扩扩增 Illumina 测测序
16、 将mRNA 随机打断成 200 nt RNA-Seq 与常规转录组规转录组 区 别别 RNA-Seq转录组转录组 应用用于基因表达丰度 检测 用于拼接（1G 数据量） 测序类型SE： 50+8PE： 91+8+91 建库方法 全程磁珠纯化切胶回收 插入片段弥散（主峰250- 330） 单一条带 Small RNA 文 库库 18-30nt范围内的RNA 结构上5端主要以尿嘧啶开始 与mRNA的降解、翻译抑制（基因沉默）以及形 成异染色质有关 调控细胞生长、发育、基因转录和翻译等生物 过程 包括siRNA , microRNA和piRNA Small RNA 文库建库流 程 谢谢 ！ 欢迎一起讨论 ！
