elisa的原理与应用

《elisa的原理与应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《elisa的原理与应用（55页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、ELISA 知识简介 03/11/15 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 1. ELISA的原理 2. ELISA的类型 3. 试剂准备：免疫吸附剂 结合物 酶底物的准备 4. 对照设定 5. 标本的采取和保存 6. 结果判断 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA） 。基础:抗 原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的 底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中 受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 1. ELISA的原理 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定

2、方法在1971年最初建立时称为酶联免疫 吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称 ELISA。 酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 1.1 抗原抗体反应 1.1.1 可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态 平衡，其反应式为： Ag+AbAgAb 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示： K=AgAbAgAb ,AgAb的解离程度与K值有关。高 亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非 常适合，两者结

3、合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体 均能保持原有的结构和活性。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 1.1.2 特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点 之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 1.1.3 最适比例 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 1.1.4 敏感性 化学比色法的敏感度为mg/ml水平 酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏

4、感度可达0.1ng/ml。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 1.4 免疫测定在临床检验中的应用 由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备 特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可 检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 2 ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方 法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂“（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物“（conjugate）； （3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法

5、。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 2.2.1 双抗体夹心法测抗原 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、 HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可 用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 2.2.2 双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检 标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于 间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关 键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合 适的标记方法。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 2.2.3 间接法测

6、抗体 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用 同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 2.2.4 竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化 抗原时，可用此法检测特异性抗体。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 2.2.5 竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点 ，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模 式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固 相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶 标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等 ELISA测定多用此

7、法。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 2.2.6 捕获包被法测抗体 IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被固相 ，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性 IgM抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早 期诊断。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 2.2.7 ABS-ELISA法 ：固相支持物； ：样品； ：特异性IgG； ：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； ：DAB显色液； ：显色； 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 3. ELISA的试剂(A、B、C三部分) ELIS

8、A中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的 底物。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 ELISA的试剂准备A 固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋 白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高， 但空白值也略高。 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明 度高，各板之间、同一板各孔之间、同一

9、板各孔之间性能相 近。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 3.1.2 包被的方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠 的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基 团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子 量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质 通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲 和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质 较多的抗原也可采用捕获包被法。 亲和素生

10、物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA ，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定 量测定。 脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇 ）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干， 待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦 佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 包被用抗原： 天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。 一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子 量太

11、小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体 的吸附，间接地结合到固相载体表面。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 3.1.4 包被用抗体 IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合 点暴露于外。 取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能 用于ELISA，以保证试验的特异性。 腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收 层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被 ，可取得更好的效果。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 3.1.5 包被的条件 pH9.6碳酸盐缓冲液 pH7.2的磷酸盐缓冲液 pH7-8的Tris-HCL缓

12、冲液。 加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜，37中保温2 小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每 批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质 的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 3.1.6 封闭 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液 再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些 空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶 ;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。 所有的ELISA固相均需封闭？ 原理

13、类型 试剂 准备 对照 标本 结果 3.4 洗涤液 在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷 酸盐缓冲液。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 ELISA的试剂准备B 3.2 结合物 即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂 1 酶的催化活性 2抗体（或抗原）的免疫活性 3含有或少含有游离的抗体（或抗原） 4结合物尚要有良好的稳定性。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 3.2.1 结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其 他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结 合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，

14、 实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总 的要求是抗原必须是高纯度的。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 3.2.2 酶 纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源 丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。 酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存， 价格低廉，有色产物易于测定等。 在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲 酶等。 HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种 复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成 ，是一种卟啉蛋白质。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 3.2.3

15、 结合物的制备 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸 盐氧化法。 （1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与 蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%-70%）和重 复性好。 交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗 体与抗体之间也有可能交联，影响效果。 （2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分 子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成 chiff氏碱而结合。简便有效. 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测 定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，

16、因此 制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测， 效果更好。 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度 时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最 合适的测定条件和测定费用的节省。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 3.2.4 结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳 定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中 加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素 （例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结 合物可加叠氮钠）。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 3.2.5 结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在 反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐温20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液， 使用时不需再行稀释，在4-8保存期可达6个月。 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 试剂准备 C 酶的底物 原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果 3.3 酶的底物 3.3.1 HRP的底物 OP